遠志皂苷對轉tau 基因果蠅阿爾茨海默病模型行為學及壽命的影響

劉 瑩，劉 莉，關慧波

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合臨床博士后流動站，哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院心血管病一科，哈爾濱 150040；3.黑龍江中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院中醫(yī)診斷教研室，哈爾濱 150040）

阿爾茨海默病（alzheimer disease,AD）是臨床常見的一種癡呆類型，也稱為“老年性癡呆”。其發(fā)病多見于老年人群，在我國60 歲以上阿爾茨海默病的發(fā)病率達7.2%。是一種以認知障礙、記憶力減退、行為異常等為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病。在阿爾茨海默病發(fā)病的多種致病因素中，基因突變或表達異常是已確定的病因，至少有70%與其相關。老年斑和神經(jīng)纖維纏結是阿爾茨海默病患者腦內相同的病理特點，Tau 蛋白是神經(jīng)纖維纏結的結構蛋白，tau 蛋白和tau蛋白基因在阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展中起到極為重要的作用。

遠志為遠志科多年生草本植物遠志（Polygala tenuifoliaWill.）或寬葉遠志（P.sibirica L.）的根，最早見于《神農本草經(jīng)》。遠志具有寧心安神功效，治療心神不安、驚悸、失眠、健忘等證。《神農本草經(jīng)》：“利九竅，益智慧，耳目聰明，不忘，強志，倍力”。《藥性論》：“治健忘，安魂魄，令人不迷”[1]。有學者對遠志做了大量的腦保護及記憶改善實驗，結果均表明遠志可以改善實驗動物的記憶能力。遠志皂苷是遠志屬植物中的主要藥效成分[2]。研究顯示，遠志皂苷具有改善記憶能力，抑制腦組織的氧化應激[3]，腦保護[4]等作用。

本實驗以轉tau 基因果蠅為模型，通過果蠅攀爬能力實驗、果蠅嗅覺記憶實驗及果蠅壽命實驗評價遠志皂苷對阿爾茨海默病的治療作用。

1 實驗材料

野生型Canton special（CS）黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）（由中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所果蠅資源與技術平臺提供）；轉tau 基因果蠅（印第安納大學伯明頓果蠅儲存中心）；遠志皂苷（成都曼思特生物科技有限公司提供）。基礎培養(yǎng)基的制備：玉米粉42 g，瓊脂3 g，蔗糖31 g，酵母粉3 g，以上材料倒入460 mL 蒸餾水，不斷攪拌并加熱，煮沸后4 min，加入2.5 g 丙酸，持續(xù)攪拌，直至冷卻。倒入高12 cm，直徑3 cm 經(jīng)高溫滅菌的指管中，培養(yǎng)基厚度約2 cm。培養(yǎng)基需倒置于干燥實驗室內24 h 以上。遠志皂苷培養(yǎng)基的制備：在基礎培養(yǎng)基中加入遠志皂苷，制成2%濃度遠志皂苷培養(yǎng)基（前期實驗得出結論2%為實驗最佳濃度）。

2 實驗方法

2.1 收集處女蠅 12 h 內孵化出的幼蟲不交配，在12 h內把雌雄果蠅分開培養(yǎng)，所得的果蠅即為處女蠅。每天晚上18:00－19:00 將培養(yǎng)瓶內的成蠅轉移，次日早晨6:00－7:00 對新羽化的果蠅進行挑選，麻醉后收集12 h 內羽化的雄性處女蠅，將其移入裝有新鮮培養(yǎng)基的玻璃指管內，每個玻璃指管30 只左右，并標明日齡。每3 d 更換1 次培養(yǎng)基。

2.2 分組方法 收集正常雄性CS 型處女蠅，喂基礎培養(yǎng)基（空白組）；轉tau 基因雄性處女蠅，喂基礎培養(yǎng)基（模型組）；轉tau 基因雄性處女蠅，喂2%濃度遠志皂苷培養(yǎng)基（遠志組）。連續(xù)喂養(yǎng)5 d（前期實驗結論，5 d 為最佳給藥天數(shù)），每2 d 更換1 次培養(yǎng)基。測試時每組果蠅各取40 只。

2.3 果蠅攀爬能力實驗 果蠅攀爬能力實驗是利用果蠅的反趨地性，通過觀察果蠅在垂直的指管內的爬行情況來測試果蠅的運動能力。將3 組待測果蠅分別裝入高×外徑×厚為12 ×3 ×0.1 cm3空指管中，果蠅置空指管內適應5 min，輕晃指管將果蠅搖至瓶底，果蠅由于習性將向上爬（正常果蠅具有反趨地性行為，即在一個垂直地面的空間內會自發(fā)地向上運動）。暗室紅燈下測試10 s 到達指管頂部的果蠅個數(shù)（A），至少連續(xù)記錄5 次，每次至少間隔1 min，每次晃動的力度一致。計算攀附指數(shù)CI ＝A／總數(shù)。記錄5 次攀爬指數(shù)取平均值。

2.4 果蠅嗅覺記憶實驗 將3 組待測果蠅分別放入空指管內饑餓2 h 后，放入1 000 mL 的燒杯中。燒杯中放有2 個50 mL 帶孔離心管，其中一個離心管內直接放入香蕉，果蠅可聞到氣味，并且通過孔洞進入離心管內時可直接吃到香蕉；另一個在香蕉的外面包有兩層紗布，果蠅可聞到氣味，但無法吃到香蕉。每隔1 h記錄進入無障礙離心管果蠅的數(shù)目，連續(xù)記錄8 h，每組記錄5 次，取平均值。

2.5 果蠅壽命實驗 每天早8 時統(tǒng)計3 組果蠅的死亡數(shù)目，直到果蠅全部死亡。每組中所有果蠅存活天數(shù)的代數(shù)平均數(shù)為本組平均壽命；每組中前半數(shù)果蠅存活天數(shù)的平均值為半數(shù)死亡時間；每組中最后死亡的10 只果蠅存活天數(shù)的平均值為本組的最高壽命。

2.6 統(tǒng)計學方法 果蠅攀爬能力實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示，采用SPSS 19.0 進行χ2檢驗，果蠅嗅覺記憶及壽命實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（）表示，采用SPSS 19.0 進行t檢驗。

3 結果

3.1 遠志皂苷對轉tau 基因果蠅阿爾茨海默病模型攀附指數(shù)的影響 見表1。

表1 遠志皂苷對轉tau 基因果蠅阿爾茨海默病模型攀附指數(shù)的影響（）

表1 遠志皂苷對轉tau 基因果蠅阿爾茨海默病模型攀附指數(shù)的影響（）

注：與模型組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

3.2 遠志皂苷對轉tau 基因果蠅阿爾茨海默病模型嗅覺記憶的影響 見表2。

3.3 遠志皂苷對轉tau 基因果蠅阿爾茨海默病模型壽命的影響 見表3。

表2 遠志皂苷對轉tau 基因果蠅阿爾茨海默病模型嗅覺記憶的影響（）

表2 遠志皂苷對轉tau 基因果蠅阿爾茨海默病模型嗅覺記憶的影響（）

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

表3 遠志皂苷對轉tau 基因果蠅阿爾茨海默病模型壽命的影響（）

表3 遠志皂苷對轉tau 基因果蠅阿爾茨海默病模型壽命的影響（）

注：與空白組比較，P ＜0.05；與模型組比較，# P ＜0.05

4 討論

實驗研究從抗氧化應激、抗炎、影響細胞周期等不同機制方面和調節(jié)不同通路方面證實遠志皂苷對神經(jīng)細胞起到保護作用。劉威等[5]研究表明遠志皂苷能通過下調Caspase-3、Bax 表達、提高細胞膜穩(wěn)定性來減輕新生大鼠神經(jīng)細胞缺氧/復氧損傷，對其神經(jīng)細胞起到保護作用。還有研究[6]證實，遠志皂苷對NAPP/PS1 雙轉基因小鼠學習記憶能力有保護作用，機制同樣與上調Bcl-2,下調Bax、Caspase-3 表達有關。遠志皂苷對丙泊酚重復麻醉大鼠學習記憶能力有保護作用，與其降低氧化應激損傷及減少細胞凋亡有關[7]。李巧[8]研究結果顯示，遠志皂苷能抑制Aβ的神經(jīng)毒性，提高細胞抗氧化能力，減輕炎性損傷，從而起到神經(jīng)保護的作用，可能與其調節(jié)AMPK/m TOR/ULK1通路，上調Beclin-1,LC3-II/I 蛋白表達而活化自噬過程，降低BACE1 活性，使Aβ 減少有關。郭新明[9]研究結果顯示，遠志皂苷能改善快速老化小鼠學習記憶能力，其機制可能與降低腦組織乙酰膽堿酯酶水平相關。倪杰等[10]以阿爾茨海默病大鼠為研究對象，發(fā)現(xiàn)遠志皂苷可以提高Aβ1-40 誘導的阿爾茨海默病大鼠的學習記憶能力，其機制可能與提高海馬低密度脂蛋白受體相關蛋白1（LRPP1）含量有關。鄭堯杰[11-12]對遠志皂苷干預Aβ 誘導的PC12 細胞功能的研究結果顯示，遠志皂苷能抑制PC12 細胞周期活化進程，與降低細胞周期蛋白表達有關，并能提高Aβ 轉運，減輕Aβ 導致的過度氧化應激對細胞的損傷等機制有關。

陳玉靜等[13]研究表明，在體外培養(yǎng)的PC12 細胞，其tau 蛋白磷酸化在某些位點上受到O-Glc NAc 糖基化修飾的負調節(jié)，遠志皂苷元能通過提高O-Glc NAc 糖基化表達，而降低 PC12 細胞tau 蛋白磷酸化水平。遠志皂苷能減輕阿爾茨海默病大鼠腦神經(jīng)元中tau 蛋白Ser396 位點過度磷酸化，減輕Aβ 造成的神經(jīng)細胞毒，其作用機制可能與PKA 蛋白表達下調，PP2A 蛋白表達上調有關[14]。

在阿爾茨海默病患者腦中的tau 蛋白明顯高于正常人，且表現(xiàn)為異常磷酸化、過度泛素化和糖基化[15]。Tau 蛋白是神經(jīng)細胞骨架相關蛋白，參與神經(jīng)細胞的骨架構成和功能。在阿爾茨海默病腦中，tau 蛋白異常磷酸化后失去了與微管蛋白的結合能力，不再參與穩(wěn)定細胞骨架及促進微管組裝功能的作用[16]。異常磷酸化的tau 蛋白損害細胞核和線粒體功能，減少軸突起始段的動作電位。病理tau 可以進一步包裝成外體，由一個神經(jīng)元釋放，被另一個神經(jīng)元攝取，促進其致病性[17]。干擾神經(jīng)信號傳導和神經(jīng)物質轉運，導致神經(jīng)元營養(yǎng)障礙[18]，并聚集成雙螺旋纖維絲（PHF），形成神經(jīng)纖維纏結（NFTs）[19]，導致阿爾茨海默病的一系列認知和行為障礙表現(xiàn)。

果蠅在1901 年被用做實驗對象，在生命科學發(fā)展的歷史長河中，果蠅扮演了十分重要的角色。各類神經(jīng)疾病的研究，如帕金森病、老年癡呆、衰老與長壽、學習與記憶、認知行為等等。以果蠅為實驗模型的原因：在確定了的13 600 個果蠅基因中，有一半蛋白與哺乳動物序列同源。果蠅的染色體組小且全，給研究操作提供了方便[20]。與脊椎動物相比，果蠅的神經(jīng)系統(tǒng)比較簡單，所以對其解剖、生理、病理等方面的研究也就相對簡單。果蠅與哺乳動物在神經(jīng)疾病發(fā)生的蛋白質基礎和信號通路，以及病證等方面都高度一致。且果蠅繁殖能力強，能夠在短期內繁殖出試驗所需數(shù)量。因此，研究神經(jīng)系統(tǒng)基本問題，果蠅模型是非常簡單、有效、易得的。轉tau 基因果蠅的制備及鑒定方法：將表達tau 基因的質粒，用PCR 法擴增并構建到PUAST 表達載體中，用顯微注射法在果蠅受精卵中注射構建好的重組分子，用mini-white 標記基因篩選，這種方法可以測出是否tau 基因整合到果蠅基因能夠表達的區(qū)域內，可以得到獨立的轉tau 基因果蠅品系。當整合成功時，mini-white 在轉基因果蠅體內編碼蛋白使得其眼睛變成紅色。

本實驗結果顯示：遠志皂苷可顯著提高轉tau 基因果蠅阿爾茨海默病模型的攀附指數(shù)。遠志皂苷顯著提高轉tau 基因果蠅阿爾茨海默病模型進入無障礙離心管的數(shù)量。遠志皂苷顯著提高轉tau 基因果蠅阿爾茨海默病模型的半數(shù)死亡時間、平均壽命、最高壽命。以上實驗所得出的結論，遠志皂苷可有效提高轉tau基因果蠅的運動能力、記憶力，延長其壽命。