基于網絡藥理學探究桃紅四物湯治療類風濕性關節炎作用機制

黃 石，段賢春，潘凌宇，陳 燕1，，汪永忠

(安徽中醫藥大學1.藥學院，2.第一附屬醫院藥學部，安徽 合肥 230031)

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以滑膜增生、關節破壞為特點的自身免疫系統疾病，主要影響外周關節，也可累及關節外器官，如皮膚、心臟、肺、眼睛等[1]；其病理變化主要從關節滑膜的破壞開始，隨之出現關節軟骨、骨破壞，進而導致關節功能障礙，甚至關節功能喪失。RA的發病機理尚不明確，西醫治療主要應用非甾體抗炎藥、改善病情的抗風濕藥、糖皮質激素、生物制劑等，雖然這些藥物能有效控制RA的發作，極大的提高RA的臨床療效，但其副作用較多，患者依從性不高，所以尋找新的治療方法極具意義。而中藥因其治療RA療效顯著、副作用小、耐受性好，近年來日益受到關注。

桃紅四物湯出自清代吳謙等所著的《醫宗金鑒》，由桃仁、紅花、當歸、熟地、白芍、川芎六味中藥組成。桃紅四物湯的功效為活血化瘀、養血補血，臨床常在該方基礎上進行藥味加減，用于治療婦科、心腦血管及RA等疾病，Fu等[2]發現桃紅四物湯通過Wnt/IP3R/CAMKII途徑減輕缺血再灌注大鼠成肌細胞鈣超載和炎癥反應；Duan等[3-4]運用質譜分析技術得到桃紅四物湯入血及入腦成分，再結合高通量測序技術揭示桃紅四物湯治療實驗性大鼠大腦中動脈栓塞的潛在靶點；李肖等[5]將桃紅四物湯與麻黃附子細辛湯通過加減治療RA，療效顯著。但桃紅四物湯發揮治療RA作用的藥效機制有待進一步闡明。網絡藥理學的整體性、系統性與中醫藥的整體觀、辯證論等基本理論相吻合，應用于中醫藥可以很好的闡述其物質基礎與作用機制[6]。據此本研究采用網絡藥理學研究手段，探討桃紅四物湯治療RA的可能作用機制，為RA的治療提供思路和參考。

1 材料與方法

1.1 桃紅四物湯活性成分的獲取基于課題組前期超高效液相色譜-四級桿串聯飛行時間質譜(UPLC-Q-TOF-MSE)收集的桃紅四物湯體外化學成分[7]，并與中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP)中的結果進行整合，得到可能存在于桃紅四物湯中的化合物。將這些化合物按照口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%、類藥性(drug-like, DL)≥0.18進行篩選，選出最可能發揮作用的有效活性成分。

1.2 桃紅四物湯成分的靶點預測使用Zinc網站(zinc.docking.org)和PubChem網站(pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下載活性成分的mol2文件或SDF文件，將其上傳至PharmMapper數據庫(www.lilab-ecust.cn/pharmmapper)，PharmMapper可以對成分的潛在靶點進行識別，勾選“Homo Sapiens”，等待預測結果。

1.3 RA疾病靶點的獲取通過OMIM數據庫(http://omim.org)、GeneCards數據庫(http://www.genecards.org)搜索“rheumatoid arthritis”，獲取RA靶點。

1.4 藥物成分靶點與疾病靶點映射獲得桃紅四物湯相關靶點以及RA的靶點之后，取兩者的交集靶點蛋白，這樣可提高篩選靶點的準確性，增大結果的可信性，再用Cytoscape 3.7.1軟件構建“成分-靶點”網絡，利用軟件中的“Network Analyzer”功能對“成分-靶點”網絡進行拓撲學分析，桃紅四物湯的成分和靶點是網絡中的節點(node)，邊(edge)代表中藥成分和其作用靶點之間的聯系。根據拓撲分析結果篩選出桃紅四物湯作用于RA的關鍵化合物。

1.5 PPI網絡的構建及關鍵靶點篩選將獲得的交集靶點上傳至 STRING 數據庫(http://string-db.org/cgi/input.pl)，構建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡，將蛋白種類設置為人源，最低相互作用閾值(minimumrequired interaction score)設置為“highest confidence(0.900)”，同時設置隱藏游離點，獲得PPI網絡。下載PPI網絡數據導入Cytoscape 3.7.1軟件，借助其“Network Analyzer”功能對PPI網絡進行拓撲分析，度值(degree)、介數(betweenness centrality，BC)均大于平均值的節點為關鍵靶點。

1.6 富集分析及“桃紅四物湯-組方藥材-成分-靶點-通路”網絡圖構建將“1.4”項結果中的交集靶點基因導入DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov)進行GO功能富集和KEGG通路富集，其中GO分析包括生物過程(biological process，BP)、細胞組成(cellular component，CC)以及分子功能(molecular function，MF)3個部分，設定FDR值獲得GO與KEGG富集結果，根據富集結果做氣泡圖。利用Cytoscape 3.7.1軟件構建“桃紅四物湯-組方藥材-成分-靶點-通路”圖。

1.7 關鍵成分與關鍵靶點的分子對接驗證將“1.4”項結果中排名前三的關鍵化合物在TCMSP數據庫中獲取其mol2格式文件，PPI網絡中排名前三的關鍵靶點蛋白，在PDB數據庫(http://www.rcsb.org)中獲取其結構，利用AutoDock vina軟件將關鍵活性成分與關鍵靶點進行分子對接，以結合能作為評價指標對對接結果進行評價，并用pymol軟件對結果進行展示。

2 結果

2.1 桃紅四物湯活性成分篩選桃紅四物湯所含107種有效成分經篩選后，共得到38個活性成分，其中桃仁3個、紅花6個、當歸18個、熟地2個、白芍3個、川芎16個，熟地與紅花的共有成分1個，川芎與當歸的共有成分7個，白芍、紅花與熟地的共有成分1個，見Tab 1。

Tab 1 The active ingredients of Tao-Hong-Si-Wu decoction

2.2 桃紅四物湯活性成分-靶點篩選整合PharmMapper網站上桃紅四物湯相關靶點，得到8 450個。去除重復值后，得到相關人類基因靶點共441個。

2.3 疾病-靶點篩選在OMIM數據庫、GeneCards數據庫搜索“rheumatoid arthritis”，獲取RA疾病靶點，剔除重復，共得到4 167個。

2.4 藥物活性成分靶點與疾病靶點的映射將桃紅四物湯活性成分對應的441個作用靶點與4 167個RA相關靶點取交集，得到桃紅四物湯潛在作用于RA疾病靶點291個，如下Fig 1，其中桃仁對應169個，紅花對應196個，當歸對應237個，熟地對應163個，白芍對應203個，川芎對應225個，構建“成分-靶點-疾病”網絡圖。網絡中有329個節點(桃紅四物湯中化合物節點38個，靶點基因節點291個)，5 037條邊。在網絡中，一個節點的度值表示網絡中與節點相連線的條數，度值越大則表示該化合物發揮作用的可能性越大。利用Cytoscape 3.7.1中的“Network Analyzer”對網絡關系的特性進行拓撲學分析，網絡中各節點的平均度值為129.153 8，平均介數為0.024 8。度值、介數均超過平均值的化合物節點有11個，見Tab 2，推測這些化合物可能是桃紅四物湯發揮治療RA作用的關鍵化合物。

Fig 1 Intersection of predicted targets of THSWD and RA

2.5 靶點PPI網絡分析及關鍵靶點的篩選將“2.4”項下得到的291個靶點基因導入 STRING 數據庫，構建蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction Networks，PPI)網絡。PPI網絡中包含232個節點和1 046條邊，表明該網絡中有232個靶點可以發生相互作用，共產生1 046次相互作用關系。拓撲學參數顯示，網絡中各節點的平均度值為9.017 2，平均介數為0.010 1。度值、介數均超過平均值的節點有33個，由Cytoscape軟件進行可視化展示，其中，節點大小與顏色表示度值的大小，節點越大，對應的度值越大，如Fig 2所示，靶點具體信息見Tab 3，推測這些靶點可能是桃紅四物湯治療RA的關鍵靶點。

Tab 2 Basic information of hubcompounds of THSWD in RA treatment

2.6 富集分析利用DAVID數據庫對桃紅四物湯治療RA的291個靶點進行GO功能富集分析以及KEGG信號通路富集分析(FDR<0.01)，GO富集分析中包括BP的相關條目59個；MF的相關條目32個；CC的相關條目15個。BP主要包括凋亡過程的負調控、類固醇激素介導的信號通路、肽基酪氨酸自磷酸化等；MF主要包括類固醇激素受體、蛋白酪氨酸激酶活性等；CC主要包括胞漿、胞外體等。將篩選出的前10個BP、MF、CC通過R語言相關程序作氣泡圖，見Fig 3。KEGG通路富集篩選得到34條信號通路(FDR<0.01),與RA相關的通路有FoxO,Ras及VEGF等14條，見Fig 4。

2.7 “成分-靶點-通路”網絡構建將桃紅四物湯治療RA的38個成分，291個靶點以及KEGG富集分析的14條可能與RA相關的通路等構建“桃紅四物湯-組方藥材-成分-靶點-通路”的網絡圖，如Fig 5所示。

2.8 分子對接驗證選取PPI 網絡中排名前3的關鍵靶點蛋白(MAPK1、SRC、PIK3R1)與表2的排名前3的關鍵活性成分(Hydroxysafflor-Yellow-A、Rutin、Kaempferol)進行對接，見Tab 4，其中Rutin與SRC的結合性最好，pymol可視化后見Fig 6。

3 討論

RA在中醫理論中屬于“痹證”的范疇，主要由于機體氣血虛弱、正氣不足，導致風寒濕邪侵襲機體，停滯于肌肉筋膜、骨骼關節，加之寒邪收澀凝結，最后引起關節重著、冷痛、屈伸受限，甚至關節變形的一種慢性疾患[8]。《類證治裁·痹證》說：“痹久必有瘀血”，祖國醫學亦有“不通則痛，通則不痛”之言。作為活血化瘀的代表方劑桃紅四物湯，可使RA患者關節經絡中的瘀滯消失從而減輕疼痛。現代藥理研究證實，桃紅四物湯有抑制骨質疏松、填充骨髓等功效，可使RA患者的骨質疏松化恢復正常，還可以降低炎癥，使毛細血管有充分的通透性，減少炎癥滲出，改善血液循環，促進炎癥吸收[9]。

Tab 3 Basic information of hub targets of THSWD in RA treatment

Tab 4 Molecular docking results

通過對38個成分和291個交集靶點構建“成分-靶點-疾病”網絡進行拓撲分析，結果表明成分中的羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor-yellow-A)、山奈酚(kaempferol)等11個化合物可能是桃紅四物湯發揮治療RA作用的關鍵活性成分。羥基紅花黃色素A已被證實可緩解多種炎癥因子的表達，姚弘毅等[10]發現羥基紅花黃色素A可通過降低骨性關節炎大鼠不同部位相關炎癥因子含量及抑制Notch1信號通路激活進而減輕軟骨損傷。山奈酚[11]可通過阻斷MAPK通路和生長因子受體3-核糖體S6激酶2信號軸，來發揮治療RA作用。

PPI網絡結果顯示，桃紅四物湯治療RA的核心靶點包括AKT1、MAPK1、JAK2等。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的家族成員之一，AKT1可調控mTOR信號通路，減少細胞凋亡，上調AKT1蛋白的表達，可抑制IL-1β誘導的軟骨細胞增殖[12]。MAPK1即絲裂原活化蛋白激酶1，MAPK參與了RA關節的炎癥和組織破壞，與RA病理狀態的維持及病情進展密切相關。JAK2屬于酪氨酸蛋白激酶家族，RA患者滑膜中細胞因子與JAK2結合，從而激活JAK/STAT信號通路，致使關節破壞，鄧龍飛等[13]發現威靈仙總皂苷通過抑制滑膜組織中JAK2mRNA表達及p-JAK2/JAK2 相對表達，進而調控JAK/STAT信號通路發揮治療RA作用。以上結果提示，桃紅四物湯可能通過調控軟骨細胞凋亡、炎癥細胞因子激活、細胞自噬或凋亡等途徑的靶點發揮治療RA作用。

Fig 2 PPI network of THSWD in treating potential targets of RA

Fig 3 Bubble diagram of GO function enrichment of potential targets from THSWD for RA treatment

Fig 4 Bubble diagram of KEGG enrichmentof potential targets from THSWD for RA treatment

KEGG通路富集結果表明，桃紅四物湯通過調控FoxO、Ras及VEGF等信號通路發揮對RA的治療效果，其中已有多條通路被證實參與了RA的發生發展。FoxO屬于叉頭框蛋白(forkhead box，FOX)家族中的一個亞類，當機體刺激FoxO時，修復和自由基清除等功能的基因表達，使細胞凋亡、修復和降解的轉錄程序啟動，同時幾種前凋亡基因也誘導損傷或異常細胞發生凋亡[14]。一般而言，氧化應激的信號匯集到下游，激活效應器caspase-3，活化的caspase-3剪切Akt，引起PI3K/Akt抑制，進而促進FoxOs蛋白轉位入核，激活其轉錄活性，促進前調亡基因(如Bim和Fas)和細胞生長停滯與DNA損傷修復基因(Gadd45a)的表達，誘導細胞周期阻滯和細胞調亡，從而清除受損或異常的細胞。RA進程中的氧化應激反應通常伴隨著FoxO3a蛋白含量的變化，且FoxO3a的活性被抑制，則谷胱甘肽過氧化物酶表達降低，使ROS的清除減少，機體的抗氧化能力減弱[15]。

Fig 5 “THSWD-prescription composition-prototype components- targets- pathways” network

Fig 6 Molecular docking diagram

Ras是單聚體鳥苷三磷酸結合蛋白，Ras能廣泛激活MAPK等通路對細胞凋亡起負向調節作用，一些藥物可能就是通過Ras信號通路介導的細胞內反應發揮治療RA作用。另有研究表明[16],Ras/Raf/MEK/ERK信號通路不僅能夠直接通過上調自噬相關蛋白表達誘導自噬，而且還能通過間接激活PI3K/Akt/mTOR信號通路促進自噬的發生。VEGF即血管內皮生長因子，VEGF在RA患者滑液和血清中大量表達，在炎癥發生時，VEGF的分泌可增高3～20倍，直接參與了滑膜血管新生，李夢等[17]發現鐵筷子醇提物可通過下調佐劑性關節炎大鼠體內VEGF的表達發揮治療作用。

分子對接結果，靶點蛋白與活性成分之間的結合活性度越高，結合能越小，表示其對接性越好，一般≤-5.0 kJ·mol-1則表示具有較好的結合性[18]，從結果可以看出，桃紅四物湯的主要活性成分與靶點蛋白結合能均<-5.0 kJ·mol-1，推測這些活性成分在治療RA中發揮重要作用。

綜上，網絡藥理學的研究結果顯示桃紅四物湯通過作用于多個靶點、多條通路共同實現對RA的治療作用。這些靶點和通路主要涉及細胞凋亡、細胞生長因子等，提示桃紅四物湯治療RA的作用機制與干預細胞凋亡、促進血管新生相關，為后期桃紅四物湯治療RA的深入研究提供基礎。