網絡藥理學在中醫藥治療自身免疫性疾病中的應用

唐加龍，周 莉，孫祖越，張立超

(1.上海中醫藥大學附屬市中醫醫院藥劑科，上海 200071；2.復旦大學藥學院，上海 200031)

自身免疫性疾病(autoimmune diseases，AIDs)是一類難治性疾病，具有多種危害，嚴重影響了患者生活質量，其中類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)、銀屑病、系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是臨床主要疾病。尋找特異生物標志物有利于疾病診斷和防治[1]。中藥天然藥物苷類、生物堿類成分用于AIDs的治療，新型炎癥免疫反應軟調節藥物芍藥苷-6-氧-苯磺酸酯也是來源于中藥活性成分芍藥苷的結構修飾產物，中藥防治不良反應少，療效確切[2]。

蛋白-蛋白互作 (protein-protein interaction，PPI)網絡對調節細胞行為至關重要，聯動的細胞信號網絡相互作用可引發復雜疾病，基于PPI網絡的構建分析鑒定具有疾病特異性的蛋白、基因等是生物標志物研究的新方法[3]。網絡藥理學通過PPI網絡探索基因和miRNA等在疾病中的整體作用機制，從大數據中鑒定有價值的生物學靶標作為疾病生物標志物和藥物靶點[4]。有研究[5-6]分別基于網絡藥理學和代謝組學、轉錄組學的整合策略發現了PPI網絡預測篩選得到的樞紐基因與中藥療效標志存在潛在關聯。AIDs發生機制諸如表觀遺傳調控作用復雜多樣，表觀遺傳基因miRNA就可調節多個靶基因形成復雜分子調控網絡參與疾病，中醫藥治療與AIDs發病均是多途徑、多靶點、多機制作用的綜合效應，傳統藥理學方法研究較為困難[4,7]。

新興的網絡藥理學研究方法在闡明疾病復雜病理機制和中藥多成分、多靶點、多途徑作用特點中得到廣泛應用。本文擬對網絡藥理學在RA、銀屑病、SLE等常見AIDs中的應用作一綜述，以期為科研人員尋找AIDs相關新的生物標志物、藥物靶點和中醫藥抗AIDs領域提供思路和方法。

1 網絡藥理學在中醫藥現代化研究中的應用

以網絡為中心的藥理分析方法在細胞或表型網絡背景下考慮藥物反應，在藥物發現中理解藥物多重作用的本質，為合理藥物設計提供支持。網絡藥理學從網絡層面系統分析生物系統、藥物和疾病之間的相互作用，以生物網絡平衡的整體觀角度解釋疾病的發生和指導新藥發現[8-9]。

網絡藥理學的思想和方法應用于中藥藥理研究，作為一種新的方法，為中醫藥現代化提供契機。整體觀和辨證論治是中醫治療疾病的主要特點，與網絡藥理學的整體系統特征相符合。中藥復方是傳統醫學在病機和中藥藥性等中醫藥基礎理論指導下臨床防治疾病的主要形式，在治療復雜疾病中有獨特優勢，目前網絡藥理學多應用于中藥復方研究，常用于揭示中藥復方治療RA、心血管疾病、婦科疾病等慢性復雜疾病的藥理作用機制，以及復方生物活性化合物篩選、新藥靶發現等[8-9]。網絡藥理學的應用現狀除了中藥藥理作用機制研究，還包括毒性機制評估，劉暢等[10]運用網絡藥理學方法揭示了山豆根導致神經系統受損引發神經毒性的主要15種毒性成分及其分子機制。由網絡藥理學發展而來的網絡毒理學篩選中藥毒性物質及闡釋致毒機制，發現中藥不良反應，促進中藥安全性評價，也是對傳統中藥藥性理論之“有毒無毒”的現代化研究[11]，未來從藥理作用機制和毒性機制研究兩方面入手，提高中藥用藥有效性與安全性，為中藥“增效減毒”的效果提供依據。

在中醫藥現代化的結合與應用還有中藥新藥研發，包括藥物重定位、單分子多靶點藥物研發等內容。如對中藥復方的藥物重定位研究，即老藥新用，以擴展新的臨床適應癥[8]。解釋中藥配伍規律[8]，揭示中藥復方通過不同水平上對多個靶標和途徑起作用的協同效應，證明中藥配伍治療疾病的有效性。中醫證候研究，通過“疾病-表型-基因-藥物”應用模型闡釋其生物學基礎[8]。中藥研究熱點質量標志物(Q-markers)的篩選, Q-marker用于中藥及復方的質量控制，從功效Q-marker和毒性Q-marker兩方面入手，建立基于“藥效-毒性”關聯評價的Q-markers為核心的質量評價體系，作為反映中藥有效性與安全性的標記物確保療效與安全用藥[9,11]。

2 網絡藥理學在自身免疫性疾病中的應用

目前用于治療AIDs藥物主要包括傳統抗風濕藥和靶向生物制劑[2]。然而甲氨蝶呤等傳統緩解病情抗風濕藥容易產生肝腎損害等毒副反應，生物制劑不僅價格昂貴而且長期使用可致癌[7]。針對AIDs復雜的致病機制，中藥具有良好免疫調節效果，雷公藤總苷和青藤堿等天然藥物均能起到抗炎、免疫抑制作用，用于AIDs的治療[2]。一項基于網絡藥理學的研究發現用于治療RA的傳統方劑清絡飲可以緩解甲氨蝶呤誘發的毒性反應，表明中醫藥治療不僅可以緩解病情療效確切，而且安全性高[12]。

另一方面，AIDs在人群中具有高發病率與死亡率，新型生物標志物發現有利于疾病診斷和防治[1]。網絡藥理學技術對基因芯片等大數據分析，高效預測AIDs潛在標志物和藥物靶點。目前基于分子靶點JAK研發的多種小分子抑制劑藥物已在臨床治療AIDs取得明確療效，如Tofacitinib、Decernotinib、Peficitinib均通過靶向JAK3治療RA[2]。Jain等[13]通過分子對接虛擬篩選JAK3的有效抑制劑，發現化合物SCHEMBL19100243 (PubChem CID-76749591)與靶蛋白具有高親和力，且該化合物的親和力得分高于已知藥物Tofacitinib。另有研究利用藥效團模型從TCMD數據庫虛擬篩選對AIDs的靶點組織蛋白酶S(Cat S)存在抑制作用的中藥化合物，得到65個Cat S天然抑制劑，這些化合物存在于58種中藥中，對58種中藥與疾病關系進一步研究證實Cat S與一些中藥治療AIDs具有相關性[14]。提示我們以分子對接為重要研究手段的網絡藥理學在虛擬篩選中藥活性成分中具有獨特優勢，是否可以從中藥化合物中發現JAK3的天然抑制劑？篩選中藥來源天然產物對于發現治療AIDs的多靶點藥物及先導化合物將是一條捷徑。

2.1 探索中藥作用機制網絡藥理學方法有助于揭示中藥及復方通過有效成分群調節機體多個靶點與通路發揮的綜合治療作用模式。

Li等[15]通過全基因組表達譜芯片檢測技術和網絡藥理學分析整合方法解析白虎加桂枝湯治療RA的物質基礎和藥理機制。靶標預測技術獲得白虎加桂枝湯候選靶標譜，與轉錄組分析得到的RA相關基因結合，構建“RA相關基因-白虎加桂枝湯靶標”相互作用網絡，發現關鍵靶點TLR4、c-Fos/AP-1、IL2、TNF直接相互作用，顯著富集于Toll樣受體和T細胞受體通路。蛋白免疫印跡實驗顯示白虎加桂枝湯顯著降低RA模型鼠的TLR4、c-Fos/AP-1、IL2、TNF的蛋白表達水平，揭示其通過調節TLR4-c-Fos-IL2-TNF信號軸恢復“炎癥-免疫”系統平衡干預RA的作用機制。

來源于洋金花的醉茄內酯組分有抗銀屑病作用，Cheng等[16]基于UHPLC/Orbitrap MS血清樣本非靶向代謝組學和網絡藥理學闡明洋金花葉醉茄內酯對銀屑病作用機制。代謝譜分析鑒定出20個脂質代謝相關標志物，網絡分析得到439個關鍵治療靶點。綜合代謝組學與網絡分析結果共有199個靶點在鞘脂代謝、VEGF和HIF-1等通路顯著富集，醉茄內酯可能靶向血管生成和炎癥反應兩條主要途徑參與銀屑病，通過酶聯免疫吸附法和蛋白免疫印跡實驗實驗進一步證實醉茄內酯可通過抑制HIF-1α/VEGF通路抑制炎癥反應和血管增生起到治療銀屑病的作用。

升麻鱉甲湯是治療SLE的中醫經典名方，Huang等[17]對升麻鱉甲湯治療SLE的分子機制進行研究，通過TCMID數據庫查找出方中所含6味中藥的390個化學成分及1 267個置信度較高的靶點，藥物靶標功能顯示升麻鱉甲湯在氨基酸、脂肪酸等代謝途徑和趨化因子、Toll樣受體、脂肪細胞因子等通路顯著富集。疾病數據庫綜合檢索到431個SLE相關基因，其中，藥物靶標與疾病基因有96個重疊核心靶點，其余1 171個一般靶點，在SLE中分別發揮不同的免疫功能途徑，但兩者在Toll樣受體信號通路又有重要聯系，揭示升麻鱉甲湯多方面治療SLE的系統療效。

2.2 篩選生物標志物和藥物靶點網絡藥理學通過生物信息學預測為高通量基因芯片數據處理提供研究方法， 通過預測分析基因、蛋白及miRNA在疾病中的整體作用，揭示其表達調控機制，在致病基因預測、藥物靶標篩選扮演重要角色。篩選具有研究價值的生物學靶標，提高疾病診斷水平和發展個體化診治。

Huang等[18]從基因表達譜數據庫GEO篩選出RA與正常對照組的104個差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)(77個上調DEGs、27個下調DEGs)，GO分析顯示上調DEGs涉及免疫系統調控等生物過程，下調DEGs參與對含氧化合物的反應等生物過程。PPI網絡篩選得到JUN、CD79A、CCL5、LCK、CD27、CXCL13、CXCL9、IL7R、CD3D、CXCL10等10個樞紐基因，PPI網絡模塊化分析得到4個活躍模塊，其中包含CCL5、CXCL6、CXCL9 CXCL10、CXCL13、ADCY2的模塊富集分析發現通過趨化因子介導信號通路生物過程參與RA的發生，CCL5及其相關基因可作為RA潛在標志物及抗RA新藥研發的重要靶點。

Gu等[19]通過UPLC-MS代謝組學技術鑒定出44個銀屑病代謝途徑紊亂相關代謝標志物，搜集與銀屑病炎癥反應、免疫應答、細胞增殖等3個系統病理過程相關靶標，分子對接計算代謝標志物與各系統蛋白的親和力，構建代謝標志物-靶標網絡，得到Chenodeoxycholic acid、5b-Cholestane-3a,7a,12a,25-tetrol、Estradiol度值中心性最高的3個代謝標志物，同樣方法篩選出TNF-α、MAPK3、iNOS、eNOS、COX-2、mTOR 6個廣泛參與以上3個系統的重要靶標蛋白，可作為銀屑病藥物靶點深入研究。

Kong等[20]通過篩選GSE65391、GSE49454基因表達數據集鑒定了女性LN-/LN+與男性LN+的90個DEGs，其中70個導入STRING數據庫存在相互作用以構建PPI網絡，從PPI 網絡篩選出DDX58、IFI44、IFI44 L、STAT1、MX1、MX2、OAS1、OAS2、OAS3、IFIT1、IFIT2、IFIT3、XAF1、ISG15、RASD2等16個樞紐基因，STAT1、DDX58、IFIT1存在強烈相互作用。張濟等[4]基于網絡藥理學方法預測了SLE患者中異常表達的miR-410受其調控，且與SLE發病相關的FASLG、CSF2、IFNAR2、MAPK1、PLCG2、IL4等靶基因，靶基因參與細胞程序性死亡、細胞增殖、粒細胞分化等生物過程，在腫瘤、細胞因子-細胞因子受體相互作用、膠質瘤等通路顯著富集，揭示miR-410通過調控多靶點、多途徑參與SLE的發病過程。

2.3 為藥物組合提供研究方法網絡藥理學為中藥配伍和中西藥物聯用等組合藥物研究提供方法。清絡飲是治療熱證型RA的傳統中藥配方組合藥物，網絡藥理研究顯示君藥苦參與其它幾味中藥通過靶向血管生成、炎癥和免疫應答等生物過程發揮協同作用，臣藥和佐使藥均起到增強君藥的治療作用，黃柏還能通過PTGS1等脫靶基因拮抗苦參的不良反應[21]，體現中醫基礎理論中“君臣佐使”和“七情配伍”中“相須”的配伍規律。Zuo等[12]通過網絡分析進一步證明方中苦參和黃柏、青風藤是發揮抗風濕作用主要組分，苦參堿、小檗堿、青藤堿分別是三味主藥的重要活性成分。利用網絡靶標法評估清絡飲與傳統抗風濕藥甲氨蝶呤聯合用藥的可行性，網絡分析發現清絡飲可部分抵消甲氨蝶呤誘導的氧化應激反應和能量代謝的毒性相關信號改變，代謝組學分析也發現清絡飲在葉酸代謝方面對甲氨蝶呤表現出拮抗作用，綜合結果揭示甲氨蝶呤與清絡飲聯合用藥可減少其副作用，顯示中西藥物聯用可達到“增效減毒”中“減毒”的目的，為提高臨床治療效果提供理論依據。

2.4 中成藥再評價由于很多中成藥藥效物質基礎不清，藥理機制不明，其有效性和安全性仍存在諸多疑問，網絡藥理學應用于中成藥成分挖掘、機制探索和不良反應預警對其再評價有重要意義。

Fan等[22]通過代謝組學、網絡分析、分子對接方法研究八味龍鉆顆?？筊A的物質基礎和作用機制。1H NMR發現16種八味龍鉆顆粒治療的代謝物變化，通過Metscape獲得16種差異代謝物的33個候選蛋白，以及疾病數據庫得到的42個RA靶標，利用UPLC-Q-TOF/MS技術鑒定的20個成分與75個RA相關蛋白分子對接發現烏藥堿和橙皮苷對接得分最高，構建的“化合物-蛋白-差異代謝物-疾病”相互作用網絡烏藥堿和橙皮苷呈現最高相關度，表明二者是八味龍鉆顆粒的潛在活性成分，為建立基于功效成分群的八味龍鉆顆粒生產過程控制體系提供參考。富集分析發現八味龍鉆顆粒通過對甾體激素生物合成、mTOR信號通路、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、酮體合成與降解等生物過程的調節發揮抗風濕作用。王曉月等[6]利用全基因組表達譜和miRNA表達譜芯片檢測技術和網絡分析篩選出hsa-miR-4720-5p，hsa-miR-374b-5p 和hsa-miR-185-3p 作為雷公藤多苷片治療RA的療效候選標志，并基于3個療效標志構建了雷公藤多苷片治療RA的藥效預測模型以減少不良反應發生，提高用藥安全。

2.5 開發中藥來源多靶點分子藥物多靶點藥物的開發有望治療慢性復雜疾病，中草藥是天然藥物研發主要來源，多靶點藥物對于AIDs等復雜疾病可以提高療效，減少副作用。雷公藤總苷、青藤堿均是可用于治療AIDs的中藥天然藥物[2]，網絡藥理學研究發現雷公藤紅素、雷公藤甲素以及青藤堿作用于RA、SLE的多靶點機制。雷公藤紅素可通過調節MMP-9、COX-2、c-Myc、TGF-β、c-JUN、JAK-1、JAK-3、IKK-β、SYK、MMP-3、JNK和MEK1等多個信號蛋白對RA的Th1和Th2細胞、巨噬細胞、成纖維細胞和內皮細胞的功能形成抑制作用[23]。通過調節VEGFA、CAT、TP53、IL-10、TNF、IL-6、IL-1β、JUN、MAPK1、AKT1、CASP3、MMP9、EGFR等信號蛋白及MAPK通路起到抗SLE作用，分子對接驗證了雷公藤紅素與CAT、IL-10、IL-1β、CASP3、TP53、VEGFA等靶點之間的特定相互作用，相互作用的主要形式為氫鍵和π-π疊加，類似于糖皮質激素抗SLE的結合形式，提示雷公藤紅素抗SLE的分子機制可能與糖皮質激素相似，可用于SLE治療的中藥免疫抑制劑[24]；雷公藤甲素通過CD274、RELA、MCL1、MAPK8、CXCL8、STAT1、STAT3、c-JUN、JNK、c-Fos、NF-κB、TNF-α調節RA患者Th1、Th2細胞、巨噬細胞、成纖維細胞和內皮細胞的活化[25]；青藤堿通過HSP90AA1、CTNNB1、RAC1、ERBB2、KIT、VAV2、HDAC6、MAP3K3、VWF、KPNB1、F13A1、MAGI1、SAMHD1、NFAT5、PRKD2、GRK6 共16個關鍵靶點抑制血管生成、滑膜增生和骨質破壞改善RA病情[26]。這些中藥單體成分是一類天然抗AIDs的單分子多靶點藥物，也為新藥開發提供先導化合物選擇。

2.6 識別中藥質量標志物(Q-markers)中藥Q-markers是劉昌孝院士提出用于控制中藥質量的新概念，其核心理念是反映中藥治療疾病本質特征，建立中藥專屬的質量評價標準，基于網絡藥理學識別Q-markers的研究策略是構建可視化候選質量標志物網絡，通過中藥成分、靶點、通路之間的網絡關系為中藥Q-markers挖掘和分析提供依據[11]。梁健欽等[27]利用網絡藥理學預測四方藤小復方治療RA的Q-markers，從構建的“藥材-化學成分-作用靶點”網絡分析得出24個與RA作用靶點有關的化合物，再結合Q-markers有效性的基本特征對24個潛在Q-marker進一步篩選，共得到橙皮苷、芹菜素、黃連堿、白藜蘆醇、巖白菜素、歐前胡素、蛇床子素、氯化兩面針堿、芳樟醇、乙氧基白屈菜紅堿、芝麻素等11個成分可作為四方藤小復方抗RA的Q-markers用于該制劑質控研究。

2.7 闡釋中醫證候生物學基礎中醫證候是對復雜疾病進行個體化診斷和治療的重要臨床表現，臨床治療常采取“同病異治”和“異病同治”治法，講究“方-證-病”對應，關鍵在于證候異同，證同同治，證異異治，網絡藥理學具體應用于研究“藥-證”對應的生物學基礎，詮釋病機理論的現代科學內涵。RA患者中醫辨證可分為寒證和熱證，中醫辨證施治采用不同的方劑，清絡飲是治療熱證RA方劑，已有研究[21]運用網絡藥理學闡明其作用機理，烏頭湯(WTD)是治療RA寒證的經典方劑，Zhang等[28]以WTD為例揭示治療RA寒證的網絡調節機制，網絡分析發現WTD作用于RA寒證的NCOA2、NCOA1、CREBBP、RXRA、MED1、PPARG等6個主要靶標，與過氧化物酶體增殖物激活受體PPAR-γ共激活因子產熱通路密切相關，隨后利用體內動物模型和體外細胞實驗得到驗證，提示PPAR-γ共激活因子產熱通路可能是WTD緩解RA寒證的潛在藥理作用靶點之一，PPAR-γ激動劑可能是一種RA寒證患者個體化治療方法。紅斑狼瘡與RA有相同的自身免疫發病機制，中醫辨為相同癥候，網絡藥理學發現火把花根片(HBHGT)在治療兩種疾病中無論靶點還是通路都有極大相似性，發揮“異病同治”的關鍵靶點有EGFR、CBL、LCK等13個核心靶點，主要信號通路是受體酪氨酸激酶通路，揭示了HBHGT對LE和RA的共同作用機制，顯示中藥治療疾病的多功能效果[29]。

2.8 設計建立疾病天然藥物數據庫銀屑病中藥數據庫(the Psoriasis Database of Traditional Chinese Medicine，PDTCM)是第一個基于高通量虛擬篩選和網絡分析等系統藥理學方法建立的銀屑病數據庫，該數據庫包含與銀屑病相關的38個中醫驗方，來自1 424種藥用植物、動物及微生物的34 373個化合物，44個蛋白和76個生物標志物。PDTCM的建立將有助于銀屑病先導化合物的發現和促進對中藥方劑分子機制的理解，為治療銀屑病相關天然產物的系統研究提供工具，一個可供用戶獲取銀屑病相關中藥的系統藥理學數據的長期資源[30]。

3 結語與展望

生物信息學方法在藥理學的運用促進了網絡藥理學的發展，采用網絡藥理學方法處理海量基因組、蛋白組數據，從大數據中尋找重要靶標，促進生物標志物和中藥作用靶點的發現，提高疾病診斷、防治、預后的精確度。在網絡醫學時代，新的生物標志物的發現依賴于多組學綜合策略[3]。單純網絡藥理學研究無法體現中藥在機體內部真實的動態情況，并且存在數據庫整合不到位，數據準確性等諸多問題。本文中多組學數據集綜合分析為整體水平中醫藥研究提供途徑，網絡藥理學結合其他組學(代謝組學、基因組學、轉錄組學)的數據分析，實現組學間數據的多重相互聯系。此外網絡藥理學與蛋白組學技術聯合，能夠直觀展示藥物在蛋白水平上的調控作用，建立相對全面的藥物-蛋白相互作用網絡。

綜上所述，中藥網絡藥理學的未來發展需要多組學技術聯合以及生物信息學、生物芯片等相關學科與技術的共同發展，多組學、多學科結合策略是未來中藥研究的重要方向。