腦缺血后神經發生與修復及中藥對其作用研究的進展

高家樂,姚明江， 徐 立， 任鈞國， 劉建勛

(中國中醫科學院西苑醫院基礎醫學研究所中藥藥理北京市重點實驗室，北京 100091)

缺血性腦卒中是腦卒中最常見的類型，目前是用重組組織型纖溶酶原激活劑進行溶栓治療，但需要在病發后4.5 h內使用，只適用于3%-5%的腦卒中患者[1]。缺血性腦卒中所致腦損傷的患者常患終身殘疾，目前治療并不能夠完全改善疾病后遺癥[2]。腦缺血后神經功能的重建與修復是治療該病的關鍵，研究表明，包括細胞移植和刺激內源性神經發生在內的以干細胞為基礎的治療，是修復和再生受損大腦的潛在策略，可能為缺血性腦卒中提供第二個治療時間窗口[3]。中藥在臨床應用于治療缺血性腦血管疾病中，根據疾病的病理病機采用辨證論治的不同治法，如益氣活血、補益肝腎，滋陰潛陽、化痰通絡等[4]，通過綜合調節發揮腦缺血后神經修復的優勢。該文從腦缺血后神經發生的過程、影響神經發生的因素及中藥對其干預作用進行闡述，以期為今后促進腦缺血后神經再生與修復的相關研究提供一些參考。

1 神經發生相關概述

1.1 內源性神經發生神經干細胞(neural stem cell，NSC)是具有多潛能的、能夠自我更新和分化可產生神經元、星形膠質細胞及少突膠質細胞的一類原始母細胞[2]，內源性NSC來源于個體本身，在成年哺乳動物腦內的腦室下區(subventricular zone，SVZ)、海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)的顆粒下區(subgranular zone，SGZ)、脊髓、紋狀體、大腦皮層等部位有所分布[5]。神經發生是指NSC經歷對稱和不對稱分裂后增殖、分化成為定向祖細胞，逐漸向功能區域遷移、不斷發生可塑性變化并與其他神經元建立突觸聯系，從而產生神經功能的過程[6]。實際上，不單是胚胎和圍產期發育階段，在整個成年期腦內的不同區域也存在著神經發生，其中SVZ和SGZ是兩個主要的神經發生位點。正常情況下內源性NSC一般處于相對靜息的狀態，但腦缺血發生后可刺激這些區域的內源性NSC增殖、遷移、分化和整合，從而激活成年腦內的神經發生。

1.2 成年腦內SVZ和SGZ區正常和腦缺血時神經發生過程側腦室SVZ區NSC是GFAP呈陽性的放射狀膠質樣B型細胞，可產生GFAP呈陰性的轉運放大C型細胞，這種C型神經祖細胞又可產生表達DCX的A型遷移神經母細胞，這些神經母細胞沿著吻側遷移流遷移到達嗅球，在那里發育為成熟的神經元，參與嗅神經再生。和SVZ區的B型細胞類似，海馬齒狀回SGZ區的I型NSC呈現類似的放射狀膠質樣形態，GFAP呈陽性，激活后可產生GFAP呈陰性的II型神經祖細胞(neuronal progenitor cell，NPC)，其可進一步細分為IIa和IIb型，其中IIb型細胞是早期的NPC，可產生表達DCX的III型神經母細胞，然后遷移到顆粒細胞層，退出細胞周期最終分化形成新的成熟神經元，將軸突投射到海馬CA3區，樹突投射到DG的分子層，并與內嗅終端形成突觸[7]。而腦缺血發生后除了增強SVZ和SGZ固有的內源性神經發生外，在損傷區分泌的化學引誘物如腦內皮細胞分泌的基質細胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)和血管生成素-1等引導下，部分新生的成鏈狀的神經母細胞能夠從SVZ沿著血管、星形膠質細胞等遷移支架向受損的缺血區域如皮層、紋狀體等部位進行長距離遷移，以重新填充受損的腦組織，但是這種向病變區域的遷移效率低下[8]。大多數研究認為這種誘發的自發性神經發生是有益的，但力量很弱，因為絕大多數神經元會死亡，缺乏存活下來的高質量的新生神經元，所以不足以修復腦缺血后的神經損傷。

2 影響腦缺血后神經發生與修復的因素及中藥干預作用

2.1 炎癥腦缺血后復雜的局部微環境會影響神經發生，適宜的微環境有利于NSC的增殖、分化和遷移，炎癥反應通過炎性因子來改變腦組織微環境從而影響神經發生。腦缺血后可激活小膠質細胞，雙向調節神經發生的過程，其既能呈現M1表型，分泌如IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ等促炎因子和活性氧，一般認為M1表型小膠質細胞能夠抑制神經發生，加重神經元損傷；小膠質細胞也可呈現M2表型，分泌如IL-4等抗炎因子和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)等，刺激神經元的增殖、遷移、分化、存活和調節突觸成熟，有助于神經發生[3]。小膠質細胞的激活狀態在腦卒中急性期、亞急性期和慢性期這三個不同階段有所變化且和缺血的嚴重程度及位置相關[9]。炎癥和隨后的神經發生二者相互作用復雜，炎癥對于腦卒中后神經發生是有益還是有害仍存在爭議，需要進一步研究。

中藥通過調控炎癥發揮對腦缺血后神經發生與修復的干預作用。Sun等[10]發現，缺血小鼠經過靜脈注射黃芪甲苷Ⅳ(astragaloside Ⅳ，AsIV)給藥治療后，海馬神經元增多，頂端樹突長度及其棘突密度增加，海馬SGZ區DCX、BrdU和Sox2蛋白的表達增加，顯著降低了腦卒中誘導的IL-17在缺血同側海馬的過度表達，機制為AsIV通過激活Wnt信號通路，下調促炎因子IL-17的表達，從而促進腦卒中后海馬神經發生和NSC增殖，改善腦卒中引起的認知功能缺陷。中醫認為，缺血性腦卒中的病機為氣虛血瘀，關鍵是本虛，氣血津液不足，臟腑機能低下。川芎為血中氣藥，具有活血行氣，祛風止痛的功效，散中能補，是臨床治療腦卒中的常用藥。Wang等[11]利用微球栓塞(microsphere-embolized，ME)法誘導持續腦缺血，研究發現，川芎(Rhizome Ligusticum Chuanxiong，LC)提取物能減輕ME所致大鼠海馬神經元的凋亡和病理形態學改變，在術后14 d能顯著增加成年大鼠海馬DG內DCX陽性細胞的產生和NeuroD1表達的密度，與模型組相比，給與LC灌胃給藥治療后，GAP-43蛋白顯著上調，促炎因子IL-1β、TNF-α和GFAP蛋白水平降低，表明LC通過促進腦缺血后海馬神經發生和抗炎來發揮神經保護作用。Zhang等[12]利用短暫性大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)誘導腦缺血模型小鼠，在造模前使小鼠口服丹參-川芎-紅花(Danshen-Chuanxiong-Honghua，DCH)提取物，劑量為10或20 g·kg-1·d-1，連續5 d，發現經過DCH預處理后可改善MCAO小鼠的神經功能，減輕腦梗死面積和腦水腫以及改善細胞凋亡和抑制炎癥反應。給MCAO大鼠口服DCH提取物，劑量20 g·kg-1·d-1，連續28 d，發現經過DCH慢性治療后可明顯改善缺血誘導的空間記憶損害，增加海馬DG區BrdU陽性細胞的數目，促進固有的神經發生過程，并增加海馬病變區BDNF的表達,表明DCH通過抑制微環境炎癥和促進海馬神經發生，從而發揮恢復認知功能障礙和抗腦缺血損傷的神經保護作用。

2.2 神經血管單元缺血性腦組織的重塑涉及神經元、膠質細胞和微血管細胞之間的相互作用，從而創造一個可能產生神經恢復的微環境。神經血管單元(neurovascular units，NVU)的神經組分由神經元和膠質細胞(小膠質細胞、星形膠質細胞、少突膠質細胞)組成，血管組分由內皮細胞、周細胞和血管平滑肌細胞組成，提供協調的神經血管偶聯并維持血腦屏障的功能[13]。腦卒中誘導的神經發生和血管之間存在聯系，腦卒中可增加血管生成，從原有血管中生成新的微血管，新舊血管似乎均可作為遷移支架使新生的神經母細胞向損傷區遷移，故重塑受損區域的血管網絡和調節新生神經元的遷移方向可提高血管引導下的神經元遷移和再生的效率。缺血區活化的內皮細胞可分泌血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，促進NSC增殖和神經元分化，還能分泌BDNF、FGF-2、促紅細胞生成素和胰島素樣生長因子-1,顯著增加SVZ和SGZ區中祖細胞的增殖[1]。

中藥通過調控神經血管單元發揮對腦缺血后神經發生與修復的干預作用。腎虛血瘀導致腦卒中發病，加重疾病惡化，而腦為髓海，通過補腎益髓，化瘀通絡，能夠到治療和保護作用。熟地甘溫，補肝腎之陰，具有補血養陰、填精益髓的功效，為養血補虛之要藥，葛根又能夠通經活絡。Xue等[14]研究發現，中藥熟地和葛根中的有效成分梓醇和葛根素(catalpol and puerarin，C-P)二者結合制成C-P凍干粉后，能夠通過抗氧化應激、抗炎、保護血腦屏障和上調保護因子來保護整個NVU，顯著減輕缺血/再灌注大鼠的神經功能缺損、腦梗死面積，促進梗死區星形膠質細胞突起和延長神經元軸突。雙側頸總動脈結扎(2-vessel occlusion，2VO) 手術后腦血流量降低，可導致慢性全腦缺血，常用來制作慢性腦低灌注動物模型和研究血管性癡呆。Li[15]等利用改良的2VO法制作慢性腦低灌注(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)大鼠模型，發生以炎癥激活、神經元丟失和星形膠質細胞增生為特征的復雜變化，這是CCH大鼠學習記憶能力低下的基礎。模型組大鼠海馬CA1區關鍵蛋白NF-kB p65、Bax、GFAP表達明顯上調，MAP-2、Olig2和Bcl-2表達明顯下調，加味薯蕷丸(Modified Dioscorea Pills，MDP)可逆轉這一趨勢，同時進一步上調GAP-43 mRNA和VEGF mRNA的表達以促進神經再生。結果表明MDP通過調節參與炎癥、凋亡、神經發生、血管生成和星形膠質細胞增生的關鍵蛋白和基因的表達來抑制炎癥、細胞凋亡和膠質增生，促進海馬NVU固有結構的恢復，有效改善CCH大鼠的學習記憶障礙。

2.3 外源性干細胞移植移植的干細胞有分化為特定的細胞亞型如神經元、內皮細胞和膠質細胞的潛能，功能性整合到宿主回路中，以便恢復整個神經血管單元和重新填充受損的區域。然而，外源性干細胞移植治療面臨免疫原性、整合度難、癌變性、倫理方面以及技術等問題。用來治療腦卒中的干細胞來源有NSC、胚胎干細胞、誘導型多潛能干細胞和間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)等，其中MSC最有前景。MSC易于獲得，可分泌多種生長因子和神經營養因子，促進神經發生和血管生成以及調節炎癥反應，增強內源性神經發生與修復[1]。Shiota等[16]研究發現，將骨髓間充質干細胞株B10移植到MCAO大鼠后，通過增加SDF-1和多聚唾液酸酶的表達能夠促進腦缺血狀態下內源性NPC的增殖和遷移；Sheikh等[17]發現，其也能通過調節缺氧誘導因子-1α和VEGF表達促進MCAO大鼠血管生成，在此過程中，IL-1β可能起重要作用。外源性干細胞移植途徑包括直接注入梗死灶、靜脈/動脈注射后通過血液擴散和腰椎穿刺注射后通過腦脊液擴散，目前關于移植治療結果的報道有好有壞，移植的有效時間窗、最佳細胞量、移植方式等[2]仍需進一步的研究。

外源性干細胞移植結合中藥干預發揮對腦缺血后神經發生與修復的作用。Liu等[18]發現， MSC移植聯合淫羊藿苷(Icariin，ICA)治療可顯著降低腦缺血/再灌注大鼠的腦梗死面積，改善運動和軀體感覺功能以及空間學習和記憶功能，ICA和MSC主要通過PI3K和ERK1/2信號通路分別促進缺血區額葉皮質和海馬中BDNF和VEGF的產生，二者在作用部位上互補，功能上相互增強，促進體內的血管生成和神經發生。Li等[19]研究發現，骨髓MSC移植聯合川芎嗪治療能夠顯著上調SDF-1和CXC趨化因子受體4的表達，并促進骨髓MSC向腦內缺血區歸巢，協同增加BDNF和VEGF的表達，促進血管生成和神經發生，說明聯合治療不僅可以促進骨髓MSC向缺血腦內的遷移，而且在增強缺血性腦卒中后內源性修復和功能性恢復方面具有協同作用。補陽還五湯具有補氣活血通絡的功效，該方重用補氣藥黃芪，并與少量活血藥配伍，使氣旺血行而治本，祛瘀通絡以治標，標本兼顧，是治療腦卒中后遺癥的常用方。研究發現，補陽還五湯通過調控Notch信號通路促進腦缺血/再灌注大鼠NSC移植后的腦保護作用，機制與上調Notch1、Hes1、Hes5的表達有關，可能為移植后的內源性NSC長期保持增殖水平提供保障，彌補移植后快速分化帶來的治療短暫性，從而增加NSC移植對腦缺血/再灌注損傷治療的持續性, 并發揮更持久的腦保護作用[20]。

2.4 外泌體外泌體是30～100 nm大小的由不同類型的細胞釋放的胞外囊泡，包裹著微RNAs (microRNAs，miRNAs)和蛋白質等生物活性物質，在正常和病理條件下均可以跨越血腦和血腦脊液屏障，介導細胞間復雜的信號傳遞。NVU中的星形膠質細胞、周細胞、小膠質細胞、內皮細胞和神經元均可以釋放和攝取外泌體，從而影響腦卒中后NVU的重塑[21]。Xin等[22]研究發現，從轉染miR-17-92簇質粒的MSC中獲得的富含miR-17-92簇的外泌體在改善MCAO大鼠神經功能、促進缺血邊界區少突膠質形成、神經發生和軸突重塑/神經樹突可塑性等方面的作用比MSC直接獲得的外泌體更顯著，促進腦卒中后神經可塑性和功能恢復，可能與通過靶向PTEN蛋白從而激活PI3K/Akt/mTOR/GSK3β信號通路有關。Yang等[23]發現，經過狂犬病毒糖蛋白修飾的攜帶著miR-124的外泌體可以有效地將miRNA靶向運輸到缺血皮層，促進皮質中NPC獲得神經元特性和增強皮質神經發生從而改善缺血性損傷。Geng等[24]發現，脂肪干細胞衍生的富含miR-126的外泌體能夠通過抑制小膠質細胞活化和炎癥反應，增強神經發生和血管再生，從而促進缺血性腦卒中后的功能恢復。

2.5 一氧化氮(NO)調控肝陽偏亢，肝陽化風，氣血并行，直沖上犯于腦，可引發缺血性腦卒中，而中藥天麻能夠平抑肝陽，熄風止痙，祛風通絡止痛，被稱為“治風之神藥”，具有補益作用，能夠助文中前面提到的中藥川芎活血和熟地補益，常用來治療缺血性腦卒中。校歡等[25]研究發現，給予天麻中的有效成分天麻素(Gastrodin，GAS)后，可改善雙側頸總動脈夾閉誘導的腦缺血模型小鼠海馬CA1區的錐體神經元病理形態學改變，海馬DG區BrdU/NeuN陽性細胞數在模型組基礎上進一步增加，激活一氧化氮合酶活性，促進NO生成，進一步增加cGMP水平和上調PKG蛋白的表達，表明GAS可能通過激活NO-cGMP-PKG信號通路促進腦缺血后海馬神經發生，改善腦缺血后小鼠的認知功能。

3 與神經再生與修復相關的其他研究

利用轉分化方法可以直接實現原位改變細胞命運，使轉分化生成的細胞補充受損或丟失的神經元以重新塑造神經回路，可避免免疫識別，是促進中樞神經系統神經再生與修復的一種潛在的策略。Qian等[26]利用6-羥基多巴胺誘導黑質神經元丟失和紋狀體多巴胺(dopamine，DA)耗竭以建造帕金森小鼠模型，將表達shPTB的腺相關病毒即AAV-shPTB注射到病變側，發現AAV-shPTB通過敲降PTB而抑制Ptbp1的表達，足以誘導內源性的中腦星形膠質細胞直接原位轉化為新的功能性的DA神經元，部分恢復黑質紋狀體多巴胺通路中丟失的DA神經元及其軸突，重建黑質紋狀體回路并逆轉運動障礙。而腦缺血會造成缺血核心區和半暗區帶的神經元壞死和凋亡，缺血后梗死核心區周圍的膠質細胞如星形膠質細胞、微血管周細胞等可被重新激活分化為神經元[1]，故利用膠質細胞的可塑性促進其向功能性神經元轉化將是促進腦缺血后神經再生與修復的一種新策略，應該進一步研究神經膠質細胞分化為神經元的原理和過程，通過轉分化或者中藥干預等手段誘導和促進這些內源性的膠質細胞增殖并向神經元轉換以補充所需要的不同類型的神經元，將是促進腦缺血后神經發生與修復的一個前景。

4 總結

腦缺血損傷后產生的病理環境不利于內源性神經發生與修復，中藥可通過促進營養因子的釋放、抑制炎癥等多種途徑來改善微環境，能夠抑制細胞凋亡和膠質增生、改善神經元的病理性損傷，促進神經血管單元的恢復等，有助于腦缺血后的神經發生與修復，在此過程中涉及多因素、多個信號通路的調節，但機制復雜尚未完全闡明，仍需進一步研究。各通路之間并非完全孤立，研究通路間的關聯可能有助于今后對中藥促進腦缺血后神經發生與修復機制的進一步研究。成年腦中內源性神經干細胞的數量和分布部位畢竟有所限制，故僅僅依靠調節內源性神經干細胞對促進腦缺血后神經發生與修復是不足夠的，外源性干細胞移植治療一直是研究熱點，但使外源性干細胞植入并增殖分化為成熟細胞的過程是不易控制的，有實驗表明外源性干細胞移植加上中藥聯合治療具有協同作用，今后可加強外源性干細胞移植結合中藥調節內源性神經發生的進一步研究，使二者互補，促進神經干細胞增殖、遷移到受損區域后分化為所需的不同的神經細胞系，整合入現有神經回路之中形成功能性的突觸連接，以期能夠修復受損神經，促進腦缺血損傷后大腦的神經結構重建與功能再生，相信以干細胞為基礎的促進神經發生與修復的不同理念與方法在今后將會得到更加深入的研究。考慮到外泌體有著跨越血腦屏障的優勢，本身又能夠促進神經發生與修復，故將外泌體作為腦靶向給藥的納米載體加以研究，則有利于發揮藥物的神經保護作用。另外，利用膠質細胞的可塑性，通過轉分化或者中藥干預等手段誘導或促進缺血梗死核心區周圍的膠質細胞增殖并向神經元轉換以替代受損或死亡的神經元也需要進一步研究。