透明質酸包裹的木犀草素膠束制備及其對小鼠肺癌移植瘤的抑制作用

肖建鵬，蔣俊，張振海，胡冰潔，王麗，何津津，蔡志慧，徐希明

(1. 江蘇大學藥學院，江蘇 鎮江 212013； 2. 江蘇省中醫藥研究院，江蘇 南京 210028)

肺癌是肺部原發性腫瘤中最常見的類型，從組織病理學和生物學特征可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌[1-2]。全球范圍內，肺癌的發病率、死亡率都極高且呈現上升趨勢[3-4]。手術切除是治療肺癌的主要方法，但受到很多條件的限制，一般只用于部分非小細胞癌的治療[5]；而小細胞癌由于轉移與擴散的發生，不適于手術治療[6]，多采用化學療法，然而傳統藥物的不良反應較大，因此限制了藥物的用量[7]。同時，耐藥性減少了藥物進入有效部位的藥量，使藥物的抗癌效果大大降低。

黃酮是一類植物次級代謝產物，具有抗氧化、防止血管增生、抗炎、抗病毒、降血糖、降血脂和抗骨質疏松等多種生物活性[8]，廣泛分布于天然產物中。木犀草素(luteolin)是一種常見的黃酮類化合物，具有高效低毒的特性。已有研究表明，木犀草素對肺癌具有防治作用，是極具開發價值的抗肺癌藥物[9]。然而，在實際應用中，為優化木犀草素的抗癌活性，一些問題尚待解決： ① 木犀草素為難溶性藥物[10]，生物利用度低，限制了其在體內抗腫瘤活性的發揮； ② 木犀草素在體內不具有靶向性[11]。

基于上述問題，本研究將制備透明質酸包裹的木犀草素膠束(HA-LE-MC)[12-13]。一方面，制備的膠束可將疏水性藥物木犀草素包裹在疏水內核，從而增加木犀草素的溶解度，提高生物利用度；其次，透明質酸具有腫瘤靶向性，引導膠束靶向于腫瘤組織。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

雙十烷基二甲基溴化銨(DDAB，南京南奧科技有限公司)；泊洛沙姆407(F127，相對分子質量9 840～14 600 Da，德國BASF公司)；透明質酸(HA，相對分子質量77 kDa，華熙福瑞達公司)；木犀草素原料藥(批號：xc20131226-5，西安小草植物科技有限責任公司)；甲醇、乙腈(色譜純，上海泰坦科技股份有限公司)，無水乙醇(分析純，上海泰坦科技股份有限公司)；超純水、PBS(實驗室自制)；Lewis細胞(中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫)；C57小黑鼠(體重18～22 g，6～8周齡，SPF級，雄性)；透析袋(相對分子質量8～12 kDa，南京南奧科技有限公司)；85-2恒溫加熱磁力攪拌器、3000HSA型激光粒度分析儀(英國馬爾文儀器有限公司)；6390LV-透射電鏡(日本電子公司)；安捷倫1200高效液相色譜儀(北京京科瑞達有限公司)。

1.2 HA-LE-MC的制備

1.2.1 制備過程 采用逆相蒸發法制備HA-LE-MC。精密稱取DDAB和F127，加入圓底燒瓶中，加氯仿10 mL，再加入木犀草素無水乙醇溶液，混勻，35 ℃全真空減壓去除有機溶劑，形成均勻薄膜，加入10 mL氯仿，再加入3 mL PBS，振搖，超聲5 min形成穩定的W/O相。35 ℃半真空減壓旋轉至凝膠狀，補加適量PBS，繼續旋轉洗脫膠狀物，得木犀草素膠束。加入適量透明質酸的PBS溶液，繼續旋轉水化1 h，過0.22 μm微孔濾膜即得透明質酸包裹的木犀草素混懸液，低溫避光保存。

1.2.2 F127與DDAB質量比對膠束制備的影響 為了探究F127與DDAB對膠束制備的影響，考察了F127∶DDAB質量比分別為9∶1，14∶1，19∶1時膠束的包封率和粒徑分布。

1.2.3 工藝驗證 通過對F127∶DDAB用量的篩選，最終確定了制備HA-LE-MC的最佳處方。

1.3 體外表征

1.3.1 HA-LE-MC的形態分布 將制備好的HA-LE-MC置于透射電鏡下觀察其表觀形態。

1.3.2 藥物含量測定

1.3.2.1 色譜條件 Aglient Zorbax SB-C18 色 譜 柱(4. 6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-水(70∶30)為流動相，等度洗脫，流速：1 mL/min；檢測波長為348 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

1.3.2.2 含量測定 ① 對照品溶液配制：量取適量木犀草素，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容制備成0.05 mg/mL的木犀草素標準溶液。② 供試品溶液配制：新鮮制備1 mg/mL的HA-LE-MC，用移液槍精密吸取100 μL,并加入900 μL甲醇后渦旋混勻1 min。將渦旋后的溶液過0.45 μm的濾膜即得。

1.3.3 包封率測定 采用透析法測定HA-LE-MC的包封率。新鮮制備HA-LE-MC 20 mL。將其中10 mL制劑放入截留相對分子質量為8～12 kDa透析袋中，將透析袋置于300 mL的50∶50水-乙醇溶液介質中，分別透析4 h和8 h后更換透析液，透析24 h后取出透析袋，用高效液相色譜法測定袋內藥物含量。同時，測定剩余10 mL未透析制劑的藥物含量，二者之比即為包封率。

1.3.4 平均粒徑與分布的測定 制備HA-LE-MC，精密量取2 mL，加入50 mL容量瓶中，用注射用水稀釋定容。取適量加至樣品池1 cm高度處，用激光粒度分析儀測定粒徑，所有結果測定3次。

1.4 體內活性實驗

1.4.1 活體成像實驗 體外培養適量Lewis肺癌細胞，接種前吸取細胞混懸液，1 000 r/min離心2 min。收集底部細胞，加滅菌PBS洗滌細胞2次，并將細胞密度調至1.5×107個/mL。接種時，先將接種部位消毒，以0.1 mL/只的劑量將Lewis細胞接種于小鼠右腋窩皮下，在給藥之前觀察并測量腫瘤直徑確定造模成功。制備含藥膠束載體，并加入0.5 mg/mL濃度的DIR染料。將含DIR的膠束載體尾靜脈注射到小鼠體內，使用IVIS Lumina Ⅱ小動物活體成像系統(美國Caliper公司)進行活體成像。

1.4.2 體內抗腫瘤實驗

1.4.2.1 小鼠腹腔接種Lewis細胞懸液 取C57小鼠4只，體重(18±2) g，從液氮罐中取出Lewis細胞常溫下解凍，隨后取無菌生理鹽水稀釋瘤株至細胞濃度為1×107個/mL瘤細胞懸液，在無菌條件下對小鼠進行腹腔接種，觀察記錄小鼠生長情況。

1.4.2.2 Lewis細胞實體瘤接種懸浮液制備方法 取接種肺癌細胞7 d的小鼠，抽取約3 mL腹腔移液(乳白色)，放入無菌容器內，冰浴上操作，加無菌生理鹽水，1 000 r/min離心5 min，洗2次后收集細胞，經臺盼藍排斥試驗檢查細胞成活率95%以上時，調成細胞濃度為1.5×107個/mL的細胞懸液備用。

1.4.2.3 分組及給藥 按隨機數字表法將36只C57小鼠隨機分為6組，每組6只，記錄各組小鼠體重。在無菌條件下，將配好的Lewis細胞株懸液(1.5×107個/mL)，接種于其中5組小鼠右上肢腋下，0.2 mL/只。接種完成后，逐日觀察接種部位有無感染，腫瘤生長后有無自然消退，每天用游標卡尺測量腫瘤長徑a和短徑b，并計算平均直徑，即r=(a+b)/2，每天記錄小鼠體重，繪制曲線。造模后的小鼠隨機分為5組：模型組，順鉑組，木犀草素原藥組，HA-LE-MC高劑量組(藥物濃度2 mg/mL)，HA-LE-MC低劑量組(藥物濃度1 mg/mL)，每組6只。造模之后每天觀察腫瘤直徑，觀察15 d以確保造模成功，隨后開始給藥。其中，順鉑組給予順鉑1 mg/mL，靜脈注射0.2 mL/只，1次/2 d；木犀草素原藥組給予木犀草素溶液2 mg/mL，靜脈注射，0.2 mL/只，1次/2 d；HA-LE-MC高、低劑量組分別給予2 mg/mL和1 mg/mL的HA-LE-MC，靜脈注射，0.2 mL/只，1次/2 d。共給藥5次。

1.4.2.4 抑瘤率及胸腺指數的測定 末次給藥24 h后(即確保造模成功后的第11天)，稱重后脫頸處死小鼠，取瘤塊稱重，計算腫瘤生長的抑制率(抑瘤率)。稱取小鼠胸腺、脾，分別計算胸腺指數和脾指數，各指標計算公式如下： 抑瘤率(%)=(模型組瘤重-治療組瘤重)/模型組瘤重×100%；胸腺指數=胸腺質量(mg)/體重(g)；脾指數=脾質量(mg)/體重(g)。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 膠束的表觀形態

透射電鏡觀察膠束的表觀形態如圖1所示，膠束呈球形，粒徑約為140 nm。

圖1 HA-LE-MC透射電鏡圖

2.2 藥物含量測定

HA-LE-MC及對照品色圖譜如圖2所示。

圖2 HA-LE-MC及對照品色譜圖

HA-LE-MC色譜圖的峰面積為985，木犀草素對照品峰面積為661。已知對照品濃度為50 μg/mL，利用外標法計算得HA-LE-MC中木犀草素濃度為75 μg/mL。

2.3 F127與DDAB質量比對膠束制備的影響

如表1所示，當F127與DDAB質量比為9∶1時，HA-LE-MC的包封率最高，粒徑最小。實際制備時，采用F127與DDAB質量比為9∶1的配比。

表1 F127與DDAB質量比對膠束的影響

2.4 活體成像實驗

尾靜脈注射加熒光染料的膠束載體0.5、2、4、6、8、10、12、24 h后的成像結果如圖3所示。從圖中可知膠束載體尾靜脈注射后集中分布在腫瘤部位，說明膠束載體具有較強的腫瘤靶向性。

圖3 HA-LE-MC在小鼠體內的分布

2.5 小鼠體重、瘤重及抑瘤率

造模之后連續15 d記錄小鼠腫瘤直徑，如圖4所示，小鼠腫瘤直徑逐漸增加，造模成功。

B～I為小鼠編號

各組小鼠體重及瘤重比較見表2，HA-LE-MC高、低劑量小鼠平均瘤重顯著低于模型組(P<0.01)，而體重無明顯差異；順鉑組小鼠平均瘤重顯著低于模型組(P<0.01)，且體重也顯著低于模型組(P<0.01)。說明HA-LE-MC對Lewis肺癌移植瘤有抑制作用，且與順鉑相比對體重的影響較小。經計算得順鉑組平均抑瘤率為70.8%，HA-LE-MC高、低劑量組的抑瘤率分別為58.4%和40.1%，木犀草素原藥組的抑瘤率為20.7%，說明HA-LE-MC的抑瘤率顯著高于木犀草素原藥組。

表2 各組小鼠體重及瘤重比較

2.6 HA-LE-MC對小鼠臟器指數的影響

與空白對照組相比，模型組小鼠胸腺指數與脾指數明顯降低(P<0.01)，說明小鼠接種Lewis細胞后免疫功能下降。與模型組比較，木犀草素原藥組臟器指數增加(P<0.05)；HA-LE-MC低、高劑量組臟器指數顯著增加(P<0.01)，調節小鼠免疫功能的效果更明顯；而順鉑組臟器指數明顯減小(P<0.05)，可能是因為順鉑毒副作用較大，從而導致小鼠免疫功能下降。見表3。

表3 各組小鼠臟器指數比較

3 討論

體內抗腫瘤實驗表明，與模型組相比，HA-LE-MC組小鼠平均瘤重顯著降低，而體重無明顯差異；順鉑組小鼠平均瘤重顯著低于模型組，且體重也顯著降低，說明HA-LE-MC對Lewis肺癌移植瘤有抑制作用，且與順鉑相比毒副作用較小。此外，與原料藥組相比，HA-LE-MC組的抑瘤率顯著增高，結合活體成像結果(熒光信號集中于腫瘤部位)，說明HA-LE-MC具有靶向性，可增加有效部位的藥量，抗腫瘤活性增強。

給藥后，與空白對照組相比，模型組小鼠胸腺指數與脾指數明顯降低，說明小鼠接種Lewis細胞后，免疫功能下降；與模型組比較，HA-LE-MC組胸腺指數與脾指數明顯增加，說明HA-LE-MC能調節小鼠免疫功能；而順鉑組胸腺指數和脾指數明顯減小，可能是順鉑毒副作用較大，從而導致小鼠免疫力下降。此外，HA-LE-MC組的胸腺指數和脾臟指數比原藥組高，說明HA-LE-MC組的治療效果優于原料藥組。綜上，HA-LE-MC具有免疫促進的作用，能改善小鼠生存狀況。

此制劑的特色在于制備方法簡單易行，制劑性質穩定，靶向性強，毒副作用低，耐藥性大大減小。透明質酸是一種天然的糖胺聚糖，具有高度的黏彈性、可塑性、非免疫原性、良好的生物相容性及可降解性等多糖類化合物特性，已成為靶向腫瘤藥物遞送的研究熱點。本研究制備的是HA-LE-MC，具有靶向性高、毒性低的特性。在保障其抗腫瘤作用的同時，大大降低其毒副作用，解決了傳統腫瘤化療藥物毒副作用大、耐藥性高等缺陷。