N-乙酰半胱氨酸對哮喘小鼠模型氣道炎癥和氧化應激的影響

徐莉莉，張軍，尚璐璐，丁慢玲，鄭金旭

(1. 江蘇大學附屬醫院呼吸科，江蘇 鎮江 212001； 2. 江蘇大學附屬澳洋醫院呼吸科，江蘇 蘇州 215600)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是以嗜酸性、中性粒細胞炎癥和氣道高反應性為特征的最常見的氣道疾病之一[1]。哮喘患者氣道中炎癥細胞和結構細胞可產生大量活性氧,機體有一定的抗氧化能力，但是當活性氧過多時，造成氣道上皮、內皮等結構不同程度的損傷，進而加重氣道炎癥，增加氣道高反應性等[2-4]。組織核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2)是一種氧化還原敏感的堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子，參與多種抗氧化基因的轉錄調控。研究表明，激活Nrf2表達能減輕卵清白蛋白(Ovalbumin，OVA)誘導的哮喘小鼠的炎癥[5-6]。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是半胱氨酸的乙酰基衍生物，增加細胞內還原型谷胱甘肽含量，中和氧化劑[7]。目前，NAC在肺部疾病中如慢性阻塞性肺疾病[8]、急性呼吸窘迫綜合征[9]、間質性肺疾病[10]等的治療中發揮抗炎、抗氧化作用。但NAC對哮喘的作用及機制尚未有明確研究[11-12]。為此，本研究探討NAC對哮喘模型小鼠氣道炎癥和氧化應激的影響及可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雌性BALB/c小鼠18只，6～8周，體重18～22 g，購自江蘇大學實驗動物中心[許可證號：SYXK(蘇)202003784]。

1.1.2 主要試劑和儀器 OVA(Ⅴ級，美國Sigma公司)；氫氧化鋁凝膠(美國Pierce公司)；氮乙酰半胱氨酸泡騰片(江蘇大學附屬醫院，進口藥品注冊證號：H20150548，意大利Zambon S.p.A.公司)；丙二醛、谷胱甘肽試劑盒(南京建成生物工程研究所)；IL-13、IL-5、IFN-γ ELISA試劑盒(美國Proteintech公司)；PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；引物及內參(GADPH)序列由金唯智公司設計合成，序列：HO-1上游5′-AAGCCGAGAATGCTGAGTTCA-3′，下游5′-GCCGTGTAGATATGGTACAAGGA-3′；Nrf2上游：5′-TAGATGACCATGAGTCGCTTGC-3′，下游5′-GCCAAACTTGCTCCATGTCC-3′；GAPDH上游5′-TGGATTTGGACGCATTGGTC-3′，下游5′-TTTGCACTGGTACGTGTTGAT-3′；超聲霧化器(江蘇魚躍醫療設備股份有限公司)；PCR儀器(美國Thermo公司)；酶標儀(美國Bio-Rad公司)；微量移液器(德國Eppendorf公司)；HE染液試劑盒(武漢谷歌生物有限公司)；血細胞計數板(上海求精有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 哮喘模型構建 參照文獻[13-14]建立哮喘模型。按隨機數字法將18只小鼠均分為對照組，哮喘組，N-乙酰半胱氨酸組，每組6只。致敏階段：第1天、第8天、第15天予哮喘組和N-乙酰半胱氨酸組每只小鼠腹腔注射致敏液0.2 mL(內含100 μg OVA+2 mg氫氧化鋁凝膠+0.2 mL PBS)；激發：于第22天開始，每天予2.5% OVA霧化吸入45 min，連續1周。對照組均予PBS替代，N-乙酰半胱氨酸組在每次霧化前30 min予NAC(300 mg/kg)灌胃，對照組和哮喘組予等量PBS灌胃。

1.2.2 取材和檢測

1.2.2.1 ELISA法測定血清中相關細胞因子含量 1%戊巴比妥(10 mL/kg)腹腔注射麻醉小鼠，待其活動減弱后，眼球采血，置于EP管，每只約1 mL；冰上靜置3 h，分離血清；4 ℃，3 000 r/min離心10 min，按照說明書分別檢測IL-5、IL-13和IFN-γ含量。

1.2.2.2 BALF細胞總數及分類計數 采血處死后，將小鼠固定于手術板，頸部常規備皮、消毒，暴露氣管，“T”形切口，插管，夾緊氣管套管，0.8 mL預冷PBS注入肺，回抽并輕輕按摩肺部。重復3次，每次回收率>80%。4 ℃，1 500 r/min離心15 min；棄上清液，用1 mL PBS重懸，用血細胞儀計數細胞總數，瑞士染色分類計數，用光學顯微鏡計至少200個細胞，按標準形態分計中性粒細胞、嗜酸性粒細胞。

1.2.2.3 肺組織樣本采集 肺泡灌洗結束后，每組小鼠均沿著頸部切口向下剪開胸部皮膚，逐層剝離肌肉和組織，暴露胸腔，取肺組織以備后續檢測。

1.2.2.4 HE染色及炎癥評分 取左肺用4%中性多聚甲醛室溫固定48 h，中間換液一次；石蠟包埋、切片4 μm，溶蠟，二甲苯脫蠟，降級濃度梯度乙醇脫水，水洗；蘇木素染色3 min，水洗；分色、氨化，水洗；伊紅液染色2 min；乙醇脫水，二甲苯透明；中性樹脂封固、烤片。在高倍顯微鏡下觀察，使用Image Pro軟件采集圖片。炎癥評分細則根據文獻[15]如下，根據血管和支氣管周圍炎癥細胞浸潤程度進行評分：0分，無炎癥細胞；1分，偶爾有炎癥細胞纏繞；2分，薄層(1～5)層炎癥細胞包圍；3分，炎癥細胞層厚>5層。

1.2.2.5 肺組織丙二醛和谷胱甘肽測定 取右肺組織，超聲勻漿機研磨，4 ℃，4 000 r/min離心15 min；取上清液，按照說明書檢測丙二醛、谷胱甘肽含量。

1.2.2.6 實時熒光定量PCR測Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達 超聲勻漿機研磨肺組織，用Trizol提取總RNA，按說明書逆轉錄合成cDNA，反應體系：引物混合液2 μL、dNTP混合液 4 μL、二硫蘇糖醇2 μL、RNA模板4 μL、 緩沖液4 μL、逆轉錄酶 1 μL和無酶水 3 μL。PCR反轉錄儀上進行孵育，42 ℃ 50 min，85 ℃ 5 min，-20 ℃保存。以cDNA為模板，配制熒光定量PCR反應體系：2×SYBR GreenⅠ預混液10 μL、上游引物0.8 μL、下游引物0.8 μL、DNA模板2 μL和無酶水6.4 μL，共20 μL。PCR條件：95 ℃反應10 min；95 ℃反應15 s；60 ℃反應60 s；40個循環，計算2-ΔΔCt值分析相關mRNA表達。

1.3 統計分析

2 結果

2.1 各組小鼠血清炎癥因子的比較

與對照組相比，哮喘組血清細胞因子IL-5、IL-13含量顯著增加(t=5.090，12.443，P<0.05)，IFN-γ含量明顯降低(t=-10.344，P<0.05)。與哮喘組相比，N-乙酰半胱氨酸組中血清細胞因子IL-5、IL-13含量明顯降低(t=-4.568，-12.981，P均<0.05)，IFN-γ含量明顯增加(t=14.109，P<0.05)。見圖1。

a：P<0.05，與對照組相比；b：P<0.05，與哮喘組相比

2.2 各組小鼠支氣管肺泡灌洗液細胞數比較

如圖2所示，與對照組相比，哮喘組白細胞總數、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞數顯著增加(t=10.491，39.099，12.323，P均<0.05)；與哮喘組相比，N-乙酰半胱氨酸組白細胞總數、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞數明顯減少，差異有統計學意義(t=-6.658，-19.704，-5.154，P均<0.05)。

a：P<0.05，與對照組相比；b：P<0.05，與哮喘組相比

2.3 各組小鼠肺組織炎癥的比較

肺組織HE染色顯示，對照組肺泡及氣道結構規整，管腔無狹窄，偶有少量炎癥細胞。哮喘組肺組織結構明顯紊亂，肺泡結構破壞明顯，管腔狹窄，炎癥滲出明顯，血管周圍水腫；N-乙酰半胱氨酸組炎癥和肺組織損傷程度較哮喘組減輕。3組中哮喘組小鼠評分最高，哮喘組評分明顯高于對照組(t=7.675，P<0.05)，N-乙酰半胱氨酸組評分明顯低于哮喘組(t=-8.935，P<0.05)。見圖3。

a：P<0.05，與對照組相比；b：P<0.05，與哮喘組相比

2.4 各組小鼠肺組織中丙二醛和谷胱甘肽含量的比較

與對照組比較，哮喘組肺組織中丙二醛含量明顯升高，谷胱甘肽含量明顯降低 (t=7.974，-4.850，P均<0.05)；與哮喘組比較，N-乙酰半胱氨酸組中丙二醛含量明顯降低，而谷胱甘肽含量明顯升高(t=-6.709，5.772，P均<0. 05)。見圖4。

a：P<0.05，與對照組相比；b：P<0.05，與哮喘組相比

2.5 各組小鼠肺組織HO-1 mRNA和Nrf2 mRNA表達比較

與對照組比較，哮喘組小鼠肺組織中Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達差異無統計學意義(P均>0.05)；與哮喘組相比，N-乙酰半胱氨酸組肺組織Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達明顯升高(P均<0.05)。見圖5。

a：P<0.05，與對照組相比；b：P<0.05，與哮喘組相比

3 討論

哮喘動物模型是研究抗哮喘藥物及探究其發病機理的關鍵步驟，以OVA誘導哮喘小鼠模型，具備與人哮喘相似的臨床癥狀和病理表現，是構建哮喘的理想模型[14]。本實驗采用OVA誘導，成功構建哮喘模型小鼠，并將NAC作為干預藥物，研究結果顯示NAC具有抗哮喘作用。

嗜酸性粒細胞和中性粒細胞是哮喘重要的效應細胞，嗜酸性粒細胞在炎癥部位釋放的顆粒蛋白刺激黏液生成，引起組織水腫和氣道阻塞，釋放各種細胞因子和趨化因子，加重炎癥[16]。中性粒細胞可以分泌多種炎癥介質和細胞因子，促進炎癥反應，導致氣道重塑[17]。哮喘與Th1/Th2細胞失衡及其特有的細胞因子譜密切相關[18]。本研究顯示，相對于對照組，OVA誘導的哮喘小鼠炎癥細胞數、IL-5、IL-13水平顯著增加，IFN-γ水平顯著降低，肺組織HE染色顯示氣道周圍有大量炎性細胞、結構紊亂、破壞。NAC的干預明顯減少炎癥細胞數量，降低Th2細胞因子水平，增加Th1細胞因子水平，減輕上述氣道病理損傷表現，且炎癥評分明顯降低。由此推測，NAC能緩解哮喘小鼠氣道炎癥反應。

丙二醛是脂質過氧化中最豐富的活性醛，是細胞損傷的重要信號分子，作為細胞和組織氧化應激的指標[19]。谷胱甘肽是細胞內主要的硫醇抗氧化劑，是活性氧清除劑，在維持上皮完整性方面起著重要作用[20]。在本研究中，NAC顯著抑制OVA誘導的氧化應激，NAC組小鼠肺組織中丙二醛含量減少，谷胱甘肽含量升高，提示NAC通過抗氧化反應對OVA誘導的哮喘有保護作用。

Nrf2/HO-1信號通路軸在調節氧化應激、炎癥反應中起關鍵作用[5,21]。為進一步研究NAC保護機制，本實驗研究NAC對Nrf2/HO-1信號通路的影響。結果表明N-乙酰半胱氨酸組Nrf2、HO-1mRNA表達明顯升高。由此推測NAC可能通過激活Nrf2/HO-1信號通路起抗哮喘作用，這與Sussan等[22]研究顯示的激活Nrf2表達能降低哮喘易感性觀點一致。