常見化療藥物對免疫酶促反應的干擾效應

張助，毛朝明，蔣茜，丁超，劉佳夢，康萍

(江蘇大學附屬醫(yī)院核醫(yī)學科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

酶免疫技術(shù)是一種最常見的標記免疫技術(shù)，過去的30多年，標記免疫測定技術(shù)廣泛用于各種免疫球蛋白、補體、腫瘤標志物、激素、病毒抗原抗體等檢測。然而，該技術(shù)是借助了免疫反應的特異性和標記技術(shù)的高靈敏性，對被檢測物的測定仍是非直接測定，反應體系易受標本源性干擾物的影響[1]，其中，藥物干擾是常見因素之一。據(jù)研究顯示，影響實驗室檢測結(jié)果的藥物達萬種[2]，化療藥物對免疫分析的干擾也時有報道[3-4]。為了更好地了解化療藥物是否干擾酶免疫分析，本研究選取17種不同類型常見化療藥物，對兩種酶反應體系的干擾情況進行分析。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品

ELISA試劑盒來自英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司；化學發(fā)光測定試劑(美國Beckman Coulter公司)。本研究所用化療藥物注射液：環(huán)磷酰胺(德國Baxter Oncology GmbH公司)，阿糖胞苷(美國輝瑞制藥有限公司)，氟尿嘧啶(天津金耀藥業(yè)有限公司)，卡鉑、依托泊苷(山東齊魯制藥有限公司)，長春新堿(深圳萬樂藥業(yè)有限公司)，紫杉醇(江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司)，多西他賽、奧沙利鉑、伊立替康(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，吉西他濱、順鉑、地西他濱、硼替佐米、培美曲塞二鈉(江蘇豪森藥業(yè)有限公司)，奈達鉑(南京先聲藥業(yè)有限公司)，郝賽汀(上海羅氏制藥有限公司)。0.9% 氯化鈉注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司)。

1.2 方法

在初篩實驗中，17種臨床化療藥物注射液作為干擾組，實驗體系中使用的藥物濃度均以臨床治療濃度為參照，即環(huán)磷酰胺為12 mg/mL，阿糖胞苷為20 mg/mL，氟尿嘧啶為20 mg/mL，吉西他濱為16 mg/mL，地西他濱為1 mg/mL，依托泊苷為0.2 mg/mL，長春新堿為0.008 mg/mL，紫杉醇為0.42 mg/mL，多西他賽為0.32 mg/mL，順鉑為0.1 mg/mL，奧沙利鉑為0.4 mg/mL，卡鉑為0.4 mg/mL，奈達鉑為0.08 mg/mL，伊立替康為1 mg/mL，硼替佐米為1 mg/mL，郝賽汀為1.56 mg/mL，培美曲塞二鈉為8 mg/mL。在藥物劑量影響實驗中，對上述干擾陽性藥物用生理鹽水做進一步的75%、50%、25%梯度濃度稀釋。在藥物血樣峰濃度的驗證實驗中，紫杉醇、多西他賽藥物峰濃度進一步稀釋至4 μg/mL。

取上述藥物各100 μL，以0.9%氯化鈉注射液為空白對照組，分別加入辣根過氧化物酶(HRP)+ 四甲基聯(lián)苯胺(TMB)反應體系以及堿性磷酸酶(ALP)+3-(2′-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷(AMPPD)反應體系中，兩種酶反應體系按試劑盒步驟嚴格操作。用Multiskan GO型酶標儀(美國Thermo公司)和SYNERGY H1型多功能化學發(fā)光儀(美國BioTek公司)檢測對應D(450 nm)值以及相對發(fā)光強度。每個樣本重復檢測3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 化療藥物對HRP+TMB和ALP+AMPPD酶反應體系的影響

在HRP+TMB酶反應體系中，培美曲塞二鈉因與終止液發(fā)生反應未列入統(tǒng)計，其余16種化療藥物在臨床治療濃度情況下對該酶反應體系的影響結(jié)果見圖1。與對照組相比，吉西他濱、硼替佐米、多西他賽、紫杉醇、氟尿嘧啶、依托泊苷呈負向干擾，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，其抑制敏感順序為：氟尿嘧啶>紫杉醇>吉西他濱>依托泊苷>多西他賽>硼替佐米。而順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、奈達鉑、郝賽汀、伊立替康、地西他濱、阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺、長春新堿與對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

在ALP+AMPPD酶反應體系中，17種化療藥物在臨床治療濃度情況下對該酶反應體系的影響結(jié)果見圖2。與對照組相比，硼替佐米、多西他賽、紫杉醇、依托泊苷、伊立替康、地西他濱、培美曲塞二鈉均呈明顯負向干擾(P<0.05或P<0.01)，其抑制敏感順序為：紫杉醇>地西他濱>培美曲塞二鈉>多西他賽>伊立替康>依托泊苷>硼替佐米。而吉西他濱、順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、奈達鉑、郝賽汀、氟尿嘧啶、阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺、長春新堿則無明顯干擾作用(P>0.05)。從以上結(jié)果來看，化療藥物對酶反應體系干擾作用表現(xiàn)在對酶催化活性的抑制，且在兩種不同的酶反應體系中，干擾藥物的種類及敏感性也不盡相同。

a：P<0.05，b：P<0.01,與對照組相比

a：P<0.05，b：P<0.01,與對照組相比

2.2 化療藥物的劑量干擾效應觀察

對酶反應體系有抑制作用的化療藥物進行75%、50%、25%的梯度濃度稀釋，以觀察該藥物的劑量干擾效應。結(jié)果見圖3。 HRP+TMB酶反應體系中，吉西他濱、多西他賽、紫杉醇、氟尿嘧啶、依托泊苷均呈劑量依賴的干擾效應，而硼替佐米無劑量依賴的干擾效應。其中，以25%稀釋度為判斷點，紫杉醇、吉西他濱的干擾效應最為明顯。ALP+AMPPD酶反應體系中，多西他賽、紫杉醇、伊立替康、地西他濱、培美曲塞二鈉均呈劑量依賴的干擾效應，而依托泊苷、硼替佐米則無劑量依賴的干擾效應，其中，以25%稀釋度為判斷點，紫杉醇、培美曲塞二鈉的干擾效應最為明顯。

A：HRP+TMB；B：ALP+AMPPD

2.3 化療藥物在血峰濃度時的干擾驗證實驗

對酶反應體系有明顯劑量干擾作用的化療藥物進一步稀釋至該藥物在人體血樣峰濃度的水平，以進一步驗證在體液標本狀態(tài)下該藥物濃度對酶促反應的干擾作用。結(jié)果顯示：在HRP+TMB酶反應體系中，與對照組相比，吉西他濱(10 μg/mL)、氟尿嘧啶(13 μg/mL)、依托泊苷(5 μg/mL)在其對應人體血峰濃度水平時干擾無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；多西他賽和紫杉醇藥物濃度稀釋至在人體峰濃度水平時(即4 μg/mL)干擾有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在ALP+AMPPD酶反應體系中，與對照組相比，依托泊苷(5 μg/mL)、伊立替康(7.75 μg/mL)、地西他濱(3.20 μg/mL)、培美曲塞二鈉(33 μg/mL)在其對應人體血峰濃度水平時干擾無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而多西他賽和紫杉醇藥物濃度稀釋至在人體血峰濃度水平時(即4 μg/mL)干擾有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時，多西他賽和紫杉醇的干擾效應呈閾值特征：即當多西他賽>26.66 μg/mL，在HRP+TMB和ALP+AMPPD酶反應體系中干擾效應可分別達到-17.3%和-26.35%；當紫杉醇>13.12 μg/mL，在HRP+TMB和ALP+AMPPD酶反應體系中干擾效應可分別達到-29.91%和-27.53%。見圖4。

*：P<0.001，與對照組相比

3 討論

標記免疫分析技術(shù)是目前臨床常用的實驗室超微量檢測方法，如化學發(fā)光標記免疫分析法、酶標記免疫分析法。HRP與ALP是酶標記免疫分析法中常見的標記酶，在臨床檢驗中廣泛應用[5]。酶是一類生物催化劑，其催化功能具有強大的信號放大作用，提高了檢測技術(shù)的靈敏度，但易受反應體系中干擾物的影響而失活，對檢測結(jié)果造成了嚴重影響。在腫瘤患者化療過程中，使用標記免疫分析技術(shù)檢測腫瘤標志物及其他腫瘤相關(guān)指標進行疾病療效的判斷是臨床常規(guī)手段，因此，其結(jié)果的準確性會對臨床醫(yī)療決策帶來重大影響。

免疫測定方法的結(jié)果會受到特異性或非特異性干擾的影響，干擾效率從0.4%到4.0%不同[6]。在免疫測定系統(tǒng)中，由于標本來源的干擾而產(chǎn)生的不規(guī)則分析錯誤不僅是可變和零星的，而且在臨床上具有誤導性，因為它們會導致假陽性和假陰性結(jié)果[7]。侯立安等[8]研究表明，藥物對酶法檢測游離脂肪酸存在負干擾。為了應對干擾，免疫檢測專家們進行了各種嘗試，稀釋實驗或采用其他方法進行分析是兩種最常用的解決方法[9]。Vogeser等[10]建議將偏離樣本參考測量程序的結(jié)果定義為不規(guī)則(個別)分析誤差，以解決個別樣品中這種分析干擾的潛在原因和性質(zhì)。然而，標記免疫分析方法的主要項目如肽激素，血漿蛋白，心功能、腎功能或腫瘤相關(guān)標志物的檢測目前還沒有參考測量程序[11]。因此，藥物對免疫分析的干擾依然是一個難以提前預警的問題。

本研究對臨床常用的17種化療藥物對標記酶免疫反應體系的干擾進行了分析。通過體外干擾實驗證實了抗代謝藥(氟尿嘧啶、吉西他濱)，抗腫瘤抗生素(依托泊苷)，抗腫瘤植物成分藥(紫杉醇、多西他賽)，抗腫瘤靶向藥(硼替佐米)對HRP酶活性有抑制作用。同時，抗代謝藥(地西他濱)，抗腫瘤抗生素(依托泊苷)，抗腫瘤植物成分藥(紫杉醇、多西他賽)，其他抗腫瘤藥(伊立替康)，抗腫瘤靶向藥(硼替佐米、培美曲塞二鈉)對ALP酶活性有抑制作用。進一步分析顯示，多西他賽及紫杉醇在體內(nèi)血樣峰濃度時仍對這兩種酶反應體系有明顯的抑制作用，推測與多西他賽及紫杉醇同屬于紫杉烷類藥物有關(guān)。多西他賽和紫杉醇在人體血樣藥物峰濃度時引起的干擾效應需要臨床檢驗工作者和臨床醫(yī)生高度重視，因為兩者皆為抗腫瘤常用藥(特別是白蛋白紫杉醇相較紫杉醇注射液，最大血液藥物濃度增加了6.5倍[12])。因此，對使用該類藥物的患者，在評估酶標記免疫分析結(jié)果時應格外謹慎，特別是采用競爭法免疫反應時常引起錯誤的高值結(jié)果，給臨床治療工作帶來了嚴重誤導。

總之，藥物干擾免疫分析是多種多樣的。藥物經(jīng)人體代謝后形成多種代謝物，且存在不同的個體差異，化療藥物的聯(lián)合應用，這些都對分析人體內(nèi)藥物對酶免疫檢測結(jié)果的影響造成一定的困難。當然，隨著質(zhì)譜等新興技術(shù)的成熟與發(fā)展，了解體內(nèi)藥物變化和提高免疫分析準確性成為可能。但是，相對于質(zhì)譜的高成本、高操作難度、特定儀器或技術(shù)等高要求，免疫分析仍是臨床最常用的方法。綜上，化療藥物對免疫技術(shù)分析中標記酶活性的直接干擾是臨床醫(yī)生和檢驗工作者值得注意的問題，對實驗室結(jié)果進行評估時應密切聯(lián)系臨床。