基于UPLC-Q-TOF-MS結合網絡藥理學的黃褐毛忍冬保肝活性成分及其潛在靶點研究

劉暢，劉雄偉，丁晶鑫，李嘉欣，尹志剛，周英,3

(1.貴州中醫藥大學藥學院，貴州 貴陽 550025； 2. 貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025； 3. 貴州省藥食同源植物資源開發工程技術研究中心，貴州 貴陽 550025)

黃褐毛忍冬(L.fulvotomentosaHsu et S. C. Cheng)是忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬屬(Lonicera)植物，為中國藥典收載山銀花的基原植物，味甘、寒，歸肺、心、胃經，具有清熱解毒、疏散風熱之功效(中國藥典，2015版)。其主要含有綠原酸、皂苷類、醇類、酯類、黃酮類等多種化合物[1-3]，具有解熱、抗菌、抗內毒素、抗病毒、抗炎、降血糖血脂、免疫調節、保肝、抗氧化功能等功效[4]。黃褐毛忍冬水提物及醇提物能夠使四氯化碳致急性肝損傷小鼠的血清谷丙轉氨酶、肝臟三酰甘油及肝臟丙二醛的含量降低，水煎液較醇提物具有更好的保肝作用[5]，但對其含有的主要藥效成分和分子作用機制尚不清楚。故鑒定黃褐毛忍冬的主要成分與作用靶點對闡釋其藥效物質基礎和分子作用機制具有重要意義。

超高效液相色譜-飛行時間質譜聯用技術(UPLC-Q-TOF-MS)目前已被廣泛應用于中藥化學成分的快速鑒定[6]，將液質聯用技術(LC-MS)掃描的碎片離子信息和化合物裂解規律與對照品或文獻比對，可快速、準確地分析中藥中所含化學成分[7]。網絡藥理學(network pharmacology)利用復雜的網絡模型構建藥物、靶點與疾病間的相互作用關系網，闡述中藥的多成分-多靶點-多途徑作用關系，可預測化學成分作用的靶點和揭示中藥成分復雜的作用機制[8]。整合化學物質組學和網絡藥理學，可為中藥質量標志物(Q-marker)的發現提供更有效的研究方法和路徑[9]。

因此，本研究擬利用UPLC-Q-TOF-MS快速解析和鑒別黃褐毛忍冬中的化學成分，同時結合網絡藥理學和生物信息學手段發現其主要作用節點和通路，預測黃褐毛忍冬保肝作用的潛在靶點。從化學物質組學和網絡藥理學角度探究黃褐毛忍冬的多成分、多靶點、多途徑保肝作用機制，為尋找黃褐毛忍冬的質量標志物，有效控制中藥質量奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 藥材及化學試劑

黃褐毛忍冬采自貴州省興義市安龍縣德臥鎮水井村，經貴州中醫藥大學魏升華教授鑒定為黃褐毛忍冬的干燥花蕾。無水乙醇(AR，天津市富宇精細化工有限公司)；乙腈、甲醇(GR，阿拉丁試劑有限公司)；乙酸(GR，北京邁瑞達科技有限公司)；蘆丁(純度≥97%)，綠原酸(純度≥98%)，新綠原酸(純度≥98%)，隱綠原酸(純度≥98%)，異綠原酸A(純度≥98%)，異綠原酸B(純度≥98%)，異綠原酸C(純度≥98%)，咖啡酸(純度≥98.5%)，上述標準品購自成都普思生物科技股份有限公司；α-常春藤皂苷(純度≥98%)，灰氈毛忍冬皂苷甲(純度≥98%)，灰氈毛忍冬皂苷乙(純度≥98%)，斷氧化馬錢子苷(純度≥98%)，木犀草苷(純度≥97%)，異槲皮苷(純度≥98%)，斷馬錢子酸(純度≥99%)，上述標準品購自成都瑞芬思生物科技股份有限公司。

1.2 主要儀器

Acquity UPLCTM液相色譜儀，Acquity UPLC?BEH C18 Column(美國Waters集團公司)，Xevo G2-XS QTof (ESI離子源，美國Waters集團公司)，SG8200HPT超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液和供試品溶液制備 分別精密稱量10 mg標準品，以甲醇有機溶液作為溶媒，超聲至標品全部溶解完全，配置成標準品儲備液，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，于4 ℃冰箱中儲存備用。取黃褐毛忍冬干品適量，蒸餾水回流提取，以料液比1∶20，1.5 h/次，提取3次，趁熱抽濾，合并3次提取的濾液，水浴蒸干得供試品浸膏，于4 ℃冰箱中儲存備用；取適量浸膏加甲醇超聲溶解，置于10 mL容量瓶中加甲醇至刻度，搖勻，制備成1 g/mL(相當于每毫升含1 g生藥的溶液)的藥液，進樣前用0.22 μm的微孔濾膜濾過。

1.3.2 色譜條件 色譜儀：Acquity UPLCTM液相色譜儀(四元梯度泵，自動進樣器，柱溫箱，二極管陣列檢測器，在線真空脫氣機)；色譜柱：Acquity UPLC?BEH C18 Column(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；柱溫：40 ℃；流動相：A相為乙腈溶液，B相為0.4%乙酸水溶液；洗脫梯度條件：流速0.4 mL/min；進樣量2 μL；色譜儀流出液不經分流直接注入質譜儀進行檢測。梯度洗脫程序: 0～1 min，5% A，95% B；1～18 min，98% A，2% B；18～20 min，5% A，95% B。

1.3.3 質譜條件 采用ESI電噴霧源，分別在正、負離子模式下采集數據，數據掃描范圍質子數/電荷數(m/z)：50～1 500。離子源參數：噴霧電壓1 500 V，錐孔采樣電壓：40 V；離子源溫度：110 ℃；氣簾氣流量：50 L/h；去溶劑氣溫度：112 ℃；去溶劑氣流量(N2)：800 L/h；碰撞能量：20～30 V；用Masslynx 4.1工作站進行數據的采集和后續分析處理。

1.3.4 藥物成分的吸收 根據Lipinski類藥五原則，將鑒定出的化合物導入Molinspiration網站(http:∥www.molinspiration.com/cgi-bin/properties)，依據其油水分配系數的對數值(logP)、相對分子質量(MW)、拓撲極性表面積(TPSA)、氫鍵給體數(nON)、氫鍵受體數(nOHNH)與旋轉鍵數(nrotb)等性質預測藥物分子的吸收情況[10-11]。符合以下規則： ① nON≤5，② nOHNH≤10，③ MW<500，④ logP為-2～5，⑤ nrotb≤10的化合物會有更好的藥動學性質，在生物體內代謝過程中會有更高的生物利用度。如果一個化合物違反了其中兩個規則將可能有水溶性或透膜性差的問題。

1.3.5 有效成分作用靶標和疾病相關靶點的收集 利用ALOGPS 2.1(http:∥www.vcclab.org/lab/alogps/)平臺，將黃褐毛忍冬化合物結構圖轉化為標準的Canonical SMILES格式。將Canonical SMILES格式文件導入Swiss Target Prediction平臺(http:∥www.swisstargetprediction.ch/)和Similarity ensemble approach (SEA)數據庫(http:∥sea.bkslab.org/)，將其屬性設置為“homo sapiens”，預測化學成分的潛在靶點，利用UniProt數據庫將這些靶蛋白轉換成對應的基因名稱。通過GeneCards(https:∥genecards.weizmann.ac.il/v3/)，以“acute liver injury”為關鍵詞檢索與肝損傷相關的基因，篩選并刪除重復靶點基因，與化合物作用的靶點基因進行交集比對，最終獲得化合物-疾病靶點。

1.3.6 “有效成分-靶點”和蛋白與蛋白相互作用網絡圖構建 將化學成分與候選靶點導入Cytoscape 3.7.1軟件，建立成分-靶點網絡。為了分析靶點間的相互作用，將候選靶點導入String數據庫，獲得靶點間相互作用關系，保存為TSV格式，把條目node1和node2數據導入Cytoscape 3.7.1軟件，計算度(degree)值，將靶點大小和顏色設置用于反映節點(node)數的大小，顏色的深淺設置用于反映結合分數的大小，從而獲得最終的蛋白互作網絡。應用KOBAS3.0(http:∥kobas.cbi.pku.edu.cn/)工具對化合物-靶點交集蛋白靶標進行KEGG通路富集分析(P<0.05)，篩選黃褐毛忍冬主要化學成分參與的生物學通路。

2 結果

2.1 黃褐毛忍冬的化學成分鑒定及吸收預測

采用UPLC-Q-TOF-MS技術對黃褐毛忍冬中的化學成分進行定性分析，通過一級和二級質譜信息分析并結合相關文獻，黃褐毛忍冬水提物樣品圖譜中共鑒定和表征出57個化學成分，主要為黃酮、有機酸、生物堿、環烯醚萜、皂苷等類型的化合物(圖1)。根據Lipinski類藥五原則，利用Molinspiration網站對所鑒定的化合物進一步進行生物利用度預測，結果發現24種成分均可能被吸收(表1)，包括奎尼酸(Quinic acid)，獐牙菜苷(Sweroside)，新綠原酸(Neochlorogenic acid)，4,6-O-亞乙基-α-D-葡萄糖(Ethylidene glucose)，綠原酸(Chlorogenic acid)，隱綠原酸(Cryptochlorogenic acid)，斷氧化馬錢苷酸(Secologanoside)，斷馬錢子酸(Secologanic acid)，5-對香豆?；鼘幩?5-p-coumaroylquinic acid)，桃葉珊瑚甙元(6′-O-beta-Glucosylaucubin)，木犀草苷(Cynaroside)，梔子苷(Gardenoside)，甲氧基香豆素(7-Methoxycoumarin)，3-O-阿魏?？崴?3-O-feruloylquinic acid)，幼枝含斷氧化馬錢子甙(Secoxyloganin)，斷馬錢子苷半縮醛內酯(Vogeloside)，幼枝含斷氧化馬錢子甙甲酯(Secoxyloganin methyl ester)，異槲皮苷(Isoquercitrin)，槲皮素(Quercetin)，山柰酚-7-葡萄糖苷(Kaempferol-7-glucoside)，山柰酚(Kaempferol)，忍冬甙(Lonicerin)，槲皮素-7-O-葡萄糖苷(Quercetin-7-O-β-glucopyranoside)，齊墩果酸(Oleanolic acid)。

A: BPI-; B: BPI+

2.2 黃褐毛忍冬主要化學成分靶點預測及篩選

利用Swiss Target Prediction數據庫篩選到329個靶點，利用SEA數據庫篩選到279個靶點，刪除重復共得到551個靶點。在GeneCards數據庫檢索與急性肝損傷相關的基因共6 089個。將此網絡與黃褐毛忍冬對應靶點功能相映射，篩選得到319個黃褐毛忍冬潛在的靶點。

2.3 候選化合物-靶點網絡分析

將化合物和靶點導入Cytoscape分析軟件，構建黃褐毛忍冬化學成分-靶點作用網絡(圖2)，其中化學成分、靶點用節點表示，化學成分與靶點的相互關系用邊(edge)表示，有16個成分作用于同一靶點碳酸酐酶2(CA2)，138個靶點僅與一個成分鏈接，存在一個化學成分與多個靶點相互作用和不同化學成分作用于同一個靶點的現象，表現了中藥的多成分、多靶點相互作用的特點。每種化合物作用于多個靶點，每個靶點也可由多個化合物產生作用。從靶點角度來看，較為重要的靶點有CA2(degree=16)，醛糖還原酶1(AKR1B1，degree=15)，碳酸酐酶1(CA1，degree=14)，碳酸酐酶9(CA9，degree=14)，血管內皮生長因子A(VEGFA，degree=14)，白介素2(IL-2，degree=13)，內質網氨肽酶基因1(ERAP1，degree=12)，成纖維細胞生長因子1(FGF1，degree=11)，成纖維細胞生長因子2(FGF2，degree=11)，醛氧化酶5(ALOX5，degree=10)，腺苷受體A1(ADORA1，degree=10)，碳酸酐酶4(CA4，degree=10)等。從化合物角度來看，較為重要的化合物為山柰酚(degree=98)、槲皮苷(degree=93)、齊墩果酸(degree=78)、甲氧基香豆素(degree=73)、梔子苷(degree=47)、隱綠原酸(degree=39)、木犀草苷(degree=39)、4,6-O-亞乙基-α-D-葡萄糖(degree=38)、山柰酚-7-葡萄糖苷(degree=38)、斷馬錢子苷半縮醛內酯(degree=35)、綠原酸(degree=34)、新綠原酸(degree=34)、奎尼酸(degree=30)、3-O-阿魏?？崴?degree=30)、異槲皮苷(degree=30)等。

2.4 靶點PPI網絡構建

將黃褐毛忍冬預防急性肝損傷的靶點導入String數據庫中，設定打分值為高置信度0.900，獲得蛋白相互作用關系，將其保存為TSV文件，導入Cytoscape中構建蛋白互作網絡，得到254個節點和1 268條邊，選取degree>10作圖，得到蛋白互作網絡(圖3)。靶點兩兩之間的互作作用各不相同，其中顏色深淺反映該靶點連接其他靶點個數的多少，用度(degree)體現，degree值越高，顏色越深(黃色)表明該靶點的作用越關鍵。對其進行拓撲分析，依據相關參數：度(degree)，介度(betweenness)，緊密度(closeness)大小，確定了網絡中的11個關鍵核心靶標：磷脂酰肌醇3-激酶(PIK3R1，degree=54)，淀粉樣前體蛋白(APP，degree=48)，絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3，degree=46)，原癌基因(SRC，degree=39)，熱休克蛋白90α(HSP90AA1，degree=36)，絲/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1，degree=36)，轉錄激活因子3(STAT3，degree=33)，血管內皮生長因子(VEGFA，degree=29)，表皮生長因子受體(EGFR，degree=29)，B細胞κ輕肽基因增強子核因子1(NFKB1，degree=28)，ppGpp合成酶基因(RELA，degree=27)。

表1 黃褐毛忍冬水提物化學成分鑒定分析

續表1

圖2 黃褐毛忍冬化合物-靶點網絡

圖3 蛋白網絡互作

2.5 靶標功能富集分析及“成分-靶標-通路-功能”網絡的構建

利用KOBAS 3.0在線軟件進行KEGG生物通路分析結果表明，319個靶點主要富集在242個信號通路(P<0.05)，得到急性肝損傷相關的26個功能條目(表2)，涉及PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、cAMP信號通路、TNF信號通路、鈣信號通路、Toll樣受體信號通路、PPAR信號通路、AMPK信號通路、Wnt信號通路、Notch信號通路、Hippo信號通路、Hedgehog信號通路等。

將富集分析得到的26個主要通路對應黃褐毛忍冬主要成分及靶點，構建“化學成分-靶點-通路”網絡模型。此網絡綠色節點代表黃褐毛忍冬中的活性成分，黃色節點代表潛在靶點，紫色節點代表調控通路，邊代表三者之間的相互作用(圖4)。從富集通路的多少來看，較為重要的通路為PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、cAMP信號通路、鈣信號通路、TNF信號通路、Relaxin信號通路等，較為重要的靶點為AKT1、PIK3R1、PRKCA、絲裂原活化蛋白激酶10(MAPK10)、核內原癌基因(JUN)、EGFR、NFKB1、糖原合成酶激酶3(GSK3B)、RELA、腫瘤壞死因子(TNF)、HRA、白介素6(IL-6)、磷酸酶C(PLCG1)、FOS、核轉錄因子κB(NFKBIA)、VEGFA、環磷腺苷效應元件結合蛋白1(CREB1)、鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶2β(CAMK2B)、胰島素受體(INSR)和白介素-1B(IL-1B)等。AKT1富集到13個相關的通路，PIK3R1富集到13個相關的通路，PRKCA富集到10個相關的通路，MAPK10和JUN富集到9個相關的通路，EGFR、NFKB1、GSK3B和RELA富集到8個相關的通路，TNF和HRAS富集到7個相關通路，IL-6、PLCG1、FOS和NFKBIA富集到6個相關通路，VEGFA、CREB1、CAMK2B、INSR和IL-1B富集到5個相關通路。多條通路之間是通過共有靶點連接，表明各條通路之間可能協同作用于黃褐毛忍冬的預防急性肝損傷作用。

表2 黃褐毛忍冬作用靶點的KEGG富集分析

綠色三角形表示活性成分；黃色圓圈表示潛在靶點；紫色箭頭表示通路

3 討論

本實驗采用UPLC-Q-TOF-MS對黃褐毛忍冬水提物的化學成分進行了定性研究，結果顯示黃褐毛忍冬提取物主要含有57種成分，其中24種化學成分可能被吸收，包括酚酸類，黃酮類、三萜皂苷類等。通過“化學成分-靶點-通路”關系網絡的搭建、拓撲參數的分析及生物通路的信息挖掘對黃褐毛忍冬保肝的化學成分、潛在作用靶點及其分子機制進行了分析，結果顯示黃褐毛忍冬中隱綠原酸、木犀草苷、綠原酸、新綠原酸、山柰酚、槲皮苷、齊墩果酸、梔子苷、斷馬錢子苷半縮醛內酯等可能作用于CA2、AKR1B1、CA1、CA9、VEGFA、IL-2、ERAP1、FGF1、FGF2、ALOX、ADORA1、CA4等靶點發揮保肝作用。

基于拓撲參數分析，較為重要的化合物為山柰酚、槲皮苷、異槲皮苷、木犀草苷、梔子苷、隱綠原酸、綠原酸、新綠原酸、齊墩果酸、奎尼酸、3-O-阿魏?？崴岬?。山柰酚能夠通過抑制JNK磷酸化，降低肝細胞氧化應激，保護線粒體功能，抵抗DNA斷裂誘發細胞凋亡，從而達到保護過量對乙酰氨基酚導致的肝細胞損傷[12]。異槲皮苷能夠通過激活Wnt/β-catenin信號通路抑制脂肪細胞分化[13]，調控AMPK信號通路改善肝細胞脂質代謝[14]。木犀草苷能夠減少非酒精性脂肪肝脂質的沉積，減輕氧化應激及炎癥反應程度，提高脂聯素受體2的表達，對非酒精性脂肪肝具有較好的保護作用[15]。綠原酸能夠通過JNK途徑抑制非酒精性脂肪性肝病大鼠模型中的自噬和胰島素抵抗，減輕高脂飲食誘導的肝損傷[16]。這些化學成分可能是黃褐毛忍冬預防急性肝損傷的關鍵成分。

通過網絡藥理學方法對其化學成分-靶點相互關系進行構建，其保肝活性主要與CA1、CA2、CA4、CA9、AKR1B1、ERAP1、ALOX5、FGF1、FGF2、VEGFA、IL-2密切相關。肝癌組織中，下調CA1和CA2的表達可促進腫瘤細胞的生長和轉移[17]。人醛氧化酶是活性氧產生的來源，其表達反映了機體產生活性氧的水平和決定了肝細胞對藥物的易感性，脂聯素可以下調醛氧化酶水平從而避免脂肪肝的形成[18]。FGF1是一種具有多種生理功能的代謝調節因子，能夠通過抑制氧化和內質網應激，保護對乙酰氨基酚誘導的肝損傷[19]。FGF2與創傷修復和細胞增殖密切相關，通過ERK1/2和JNK信號協同調節肝細胞的有絲分裂[20]。

進一步分析黃褐毛忍冬急性肝損傷靶點所涉及的信號通路，通路富集分析結果顯示主要涉及PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、cAMP信號通路、TNF信號通路、鈣信號通路、Toll樣受體信號通路、PPAR信號通路、AMPK信號通路、Wnt信號通路、Notch信號通路、Hippo信號通路、Hedgehog信號通路等。Hedgehog信號通路通過調節效應細胞的增殖和活化，并抑制細胞的凋亡，在損傷肝臟的再生修復進程中發揮重要的作用[21]。Hippo信號通路能夠影響肝星狀細胞的轉分化、增殖和凋亡，進而影響藥物及膽汁淤積引起的肝纖維化的發生[22]。在成熟的健康肝臟中，Wnt/β-catenin信號通路途徑幾乎是無活性的，但在肝臟腫瘤的發生和發展、肝臟炎癥、肝硬化、肝臟局灶性結節性增生等肝臟疾病的發生中扮演重要的角色[23-25]。Wnt/β-catenin信號通路能夠與Hippo/YAP信號通路、NF-κB信號通路以及Notch信號通路等存在多位點的交叉聯系，在機體生理病理過程中的功能性關聯具有牽一發而動全身的聯動效應[26]。黃褐毛忍冬作用于急性肝損傷是多靶點、多通路、多功能的復雜網絡結構機制，多條通路協同發揮作用。

綜上所述，本研究基于UPLC-Q-TOF-MS分析技術對黃褐毛忍冬水提物中化學成分進行了鑒定，并利用化學物質組學與網絡藥理學方法初步分析了黃褐毛忍冬預防急性肝損傷的主要化學成分，探討了其預防急性肝損傷可能的分子機制，為黃褐毛忍冬質量標志物的確定奠定了研究基礎。