連續4年施用生物炭對植煙褐土微生物群落結構的影響

殷全玉, 劉健豪, 劉國順, 楊欣鈴, 李小福,張玉蘭, 李陽, 葉紅朝

(1.河南農業大學煙草學院, 鄭州 450002; 2.河南中煙工業有限責任公司技術中心, 鄭州 450000; 3.河南省煙草公司洛陽市公司, 河南 洛陽 471000)

生物炭是由生物質原料(動物骨骼及殘骸、植物殘體、農作物廢棄物等)在缺氧或無氧的條件下經相對較低的溫度(一般不超過700 ℃)熱裂形成的高穩定性的富含碳的物質[1]。由于生物炭在有機廢棄物資源化、土壤改良、肥料創新和溫室氣體減排等方面具有重要意義，近年來被廣泛研究[2]。生物炭自身多孔、表面積較大，含有較多碳源的性質，能為土壤微生物提供優良的生存空間和營養物質，直接影響微生物生長，也可以通過施入土壤改變土壤各項理化性質(水分、肥力、pH、CEC、EC等)來改變土壤資源儲備、土壤非生命成分及固定土壤污染物等方面，間接影響土壤微生物的生活[3]。

生物炭近年來被廣泛應用于土壤改良和修復，而微生物作為土壤的重要組成部分，其自身生長代謝的影響受生物炭的影響，在一定水平上反映了生物炭對土壤質量的影響效果[4-5]。生物炭對土壤微生物活性和群落結構組成的改變往往與試驗條件、生物炭自身性質、土壤質地及肥力水平等密切相關[6]。已有研究表明，不同原材料(如廢棄物[7]、木材[8]、作物秸稈[9]等)對土壤微生物的影響差異顯著，這是由于原材料不同的生物炭其自身結構、組分不同，常會被不同的微生物群體所利用[10]。土壤類型也是影響生物炭對土壤微生物作用的重要因素[11]，由于我國面積廣闊，土壤類型不一，生物炭對不同土壤的影響效果也不同。如生物炭在黑土和紅壤中微生物量和群落結構特征影響效果相反[12]，在灰漠土和風沙土上對微生物多樣性也有差異[13]。適宜的生物炭用量可以促進作物生長，然而過量的生物炭對作物生產不利，且對微生物產生毒性[3，14]，如何確定合適的生物炭量來修復土壤，維持土壤微生物環境穩定十分必要。

褐土是華北平原主要的耕地土壤之一，但多分布于丘陵山地，土壤侵蝕現象嚴峻，具有有機質含量偏低，保肥保水性能較差等特點[15]。目前生物炭對于土壤的修復研究多為短期實驗，而關于長期施用生物炭對褐土土壤微生物影響的報道尚不多見。本試驗因地制宜，利用當地主要作物花生殼為生物炭原料，通過4年的定位試驗，并利用高通量技術檢測土壤微生物的主要特征結構，為確定長期使用花生殼生物炭改良褐土微生物群落結構提供支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗于2014—2017年在河南農業大學許昌校區現代煙草農業科教園區(北緯34°01′，東經113°49′)進行，供試土壤類型為褐土，質地中壤，有機質含量12.77 g·kg-1，堿解氮含量81.6 mg·kg-1，速效磷含量14.4 mg·kg-1，速效鉀含量61.22 mg·kg-1，pH 7.56。供試生物炭是由河南惠農土質保育研發有限公司提供的在350 ℃條件下加工成的花生殼生物炭，其理化性狀如表1所示。供試煙草品種為K326，由本實驗室保存。

表1 花生殼生物炭理化性質Table 1 Physicochemical properties of peanut shell biocharcoal.

1.2 試驗設計

2014年設4個處理，分別是CK(30 kg·hm-2純氮)、B1.5(1.5 t·hm-2生物炭+30 kg·hm-2純氮)、B15(15 t·hm-2生物炭+30 kg·hm-2純氮)，B45(45 t·hm-2生物炭+30 kg·hm-2純氮)，每個處理占地面積333 m2(33.3 m×10 m)，設三次重復，采用完全隨機區組設計，分為三個小區，每年3月中旬撒施生物炭，4月下旬起壟施化肥，5月1日移栽煙苗，9月底煙葉采收結束，拔除煙桿，犁地耙平，至第二年3月再撒施生物炭。除生物炭用量外，其他田間措施保持一致。

1.3 樣品采集

于2018年3月中旬施炭前采集0—20 cm土壤樣品，每個小區采用 5 點法取土后混勻，共12個樣品，用冰盒帶回實驗室，每個樣品分為2份，其中一份置于-80 ℃冰箱內保存，用于提取土壤DNA，分析微生物多樣性；另一份樣品室內晾干、過篩，用于土壤基礎肥力測試。

1.4 指標測定及分析方法

1.4.1土壤理化指標分析方法 全氮、全炭用全自動CN分析儀(vario MAX CN，德國)測定；硝態氮和銨態氮用全自動化學分析儀(Smartchem140，意大利)測定；土壤pH采用電位法(ZD-型酸度計)；有機質采用紫外分光光度法；速效磷含量采用0.5 mol·L-1NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法；速效鉀含量采用NH4OAc浸提-火焰光度計法，堿解氮用全自動化學分析儀(Smartchem140，意大利)測定[16]。

1.4.2土壤樣品DNA提取、擴增與測序 本試驗將凍存的土壤樣品用干冰包裝后送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司提取樣品總DNA，以土壤總DNA為模板，以515F(5′-GTGCCAGCMGC-CGCGGTAA-3′) 和 806R(5′-GGACTACHVGGGT-WTCTAAT-3′)為引物擴增細菌16S V3-V4區DNA序列，以3F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAAC-AAGG-3′) 和4R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGAT-GC-3′)為引物擴增真菌ITS1區DNA序列，利用New England Biolabs 公司的NEB Next?UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina構建文庫，使用HISeq(HISeq PE300，美國)測序。

1.4.3數據分析方法 使用Cutadapt(V1.9.1)、UCHIME Algorithm對序列進行閱讀、處理，去除嵌合體序列得到最終的有效數據。利用Uparse 軟件(Uparse v7.0.1001)以97%的相似性將序列聚類，并與SSUrRNA數據庫進行比對分析。

使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計算Chao1、Shannon、Simpson、ACE指數，PCA分析、RDA分析、mantel text檢驗均使用R軟件分析，使用SPSS 22軟件進行單因素方差分析與Pearson相關性分析。試驗數據處理用 Microsoft Excel 2016 進行整理。

2 結果與分析

2.1 生物炭對植煙褐土理化特性的影響

如表2所示,與對照相比，施用生物炭各處理均顯著提高各處理土壤速效磷、速效鉀、有機質、pH和含水率，顯著降低了土壤容重。隨著生物炭量的不斷提高，土壤速效鉀、有機質、pH和含水率均不斷升高，速效磷含量先降低后升高，土壤容重不斷降低，且不同處理間各項指標存在顯著性差異。T2處理顯著提高了土壤銨態氮含量，但其他處理對土壤硝態氮、銨態氮影響均不顯著。綜上，施用生物炭后土壤的理化性質發生顯著改變，且各項指標變化趨勢均反映出土壤質量有所提高，不同生物炭量間對土壤理化性質的影響也有不同，其中T2、T3處理效果較好。

表2 植煙褐土理化特性Table 2 Physicochemical properties of tobacco-growing cinnamon soil.

2.2 樣品測序結果分析

各處理樣品覆蓋度均在97%以上，稀釋曲線(圖1)已趨于平穩，能夠反映樣本的真實情況。

共測得細菌16S rRNA基因序列850 439條，每個樣品平均序列70 870條。經過對序列進行聚類劃分后得到OTU數為4 905，分別歸類于47門、51綱、112目、196科、417屬、253種。

真菌18S rRNA基因序列985 622條，每個樣品平均序列82 135條。經過對序列進行聚類劃分后得到OTU數為2 152，分別歸類于14門、38綱、85目、156科、254屬、263種。

各處理間細菌、真菌OTU數與α多樣性指數(表3)均無顯著性差異，說明施用生物炭對土壤微生物多樣性影響不顯著。

表3 測序結果及α多樣性指數表Table 3 Sequencing results and alpha diversity index table

2.3 生物炭對優勢菌群相對豐度的影響

圖2中，變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)為優勢細菌，共占細菌OTU總量的81.62%，各菌種相對豐度分別為28.52%、21.84%、13.24%、11.34%、6.68%。

圖2中，子囊菌門(Ascomycota)、被孢霉菌門(Mortierellomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)為優勢真菌，共占真菌OTU總量的50.77%，各菌種相對豐度分別為34.87%、8.30%、7.60%。

與對照處理相比，T2處理對優勢細菌、真菌相對豐度影響最為顯著，其變形菌門、放線菌門、綠彎菌門、子囊菌門的相對豐度顯著提高, 酸桿菌門、擬桿菌門的相對豐度顯著降低。T1處理顯著降低了子囊菌門的相對豐度，其他處理對菌群影響均不顯著。說明適量生物炭對土壤優勢菌群影響效果顯著，但用量過高或過低對土壤優勢菌群影響效果較弱。

2.4 生物炭對群落結構的影響

PCA分析(圖3)中，細菌第一、二主成分的方差貢獻率分別為14.66、12.09%，真菌第一、二主成分的方差貢獻率分別為13.26%、11.08%。各處理所含樣品點大多分布較近，且不同處理間有明顯的分離現象。說明生物炭改變了土壤細菌、真菌群落結構分布，且不同生物炭量間群落結構也存在差異，低生物炭量對細菌群落結構影響較小，對真菌群落結構影響較大，隨著生物炭量的提高，細菌群落結構差異不斷增大，而真菌群落結構差異先增大后減小。

2.5 環境因子與不同施炭量下微生物群落的冗余分析

從圖4可以看出，細菌RDA分析中第一、二排序軸解釋量分別為26.15%、20.19%，真菌RDA分析中第一、二排序軸解釋量分別為24.07%、15.58%。各處理均位于不同區域，也表明不同處理群落結構存在差異，不同土壤理化指標指向了不同處理，速效鉀、有機質、含水率與T3處理有較強相關性，全氮、銨態氮與T2處理有較強相關性，說明不同土壤理化指標在不同處理下的對微生物群落結構的影響效果并不相同。

2.6 各環境因子與優勢菌群相關性分析

2.6.1土壤環境因子與細菌和真菌群落結構相關性分析 由Mantel text檢驗結果(表4)來看，土壤全氮(r=0.670 1，P=0.001)、銨態氮含量(r=0.740 2，P=0.001)與細菌群落結構有極顯著相關關系。土壤銨態氮含量(r=0.283 3，P=0.039)、速效鉀(r=0.262 3，P=0.049)、土壤容重(r=0.268 4，P=0.034)與真菌群落結構有顯著相關關系。說明氮素含量是影響土壤細菌群落結構的主要因素，而真菌則與土壤多項理化指標影響有關。

表4 土壤環境因子與細菌和真菌群落結構相關性Table 4 Mantel test of correlation between soil environmental factors and community structure of bacteria and fungi

2.6.2優勢菌群與土壤理化性質相關性分析

由皮爾遜相關性分析(表5)表明，Acidobacteria與土壤全氮、銨態氮顯著負相關。Actinobacteria與土壤全氮、銨態氮顯著正相關。Chloroflexi與土壤全氮、硝態氮顯著正相關。Ascomycota與土壤銨態氮、pH顯著正相關，與土壤容重顯著負相關。Mortierellomycota與土壤容重顯著負相關。說明土壤中優勢細菌相對豐度主要與土壤全氮、銨態氮含量有顯著關系，而優勢真菌則受多種土壤理化性質影響，這也與Mantel text檢驗(表4)結果一致。綜上，土壤理化性質與土壤優勢細菌、真菌相對豐度以及群落結構密切相關，土壤理化性質的改變能引起土壤優勢細菌、真菌相對豐度以及群落結構發生改變。

表5 優勢菌群與土壤理化性質相關性Table 5 Correlation between dominant microflora and soil physical and chemical properties

3 討論

3.1 生物炭對土壤理化性質的影響

施用生物炭較對照顯著提高了土壤有機質含量，土壤有機質中含有的大量營養元素礦化后可以被微生物利用，從而促進微生物的生長，同時有助于土壤質量的提高，土壤有機碳作為土壤有機質的重要組成部分，對土壤肥力和作物產量至關重要[14]。而生物炭作為富含碳的物質，施入土壤后有助于提高土壤碳含量，從而提高土壤有機質含量。已有研究結果表明，不同生物炭量間對土壤(水稻土、紫土)有機碳影響存在差異[17]，而本研究也證明在褐土中，不同生物炭量對土壤有機質影響差異顯著，而確定最佳的生物炭量是提高土壤質量的關鍵。生物炭對土壤pH影響并不顯著。這可能與試驗地植煙前pH較高有關，楊鐵釗等[18]提出，生物炭作為堿性物質可以直接提高土壤pH，但對于堿性土壤影響并不顯著，這與本文研究結果一致。生物炭施入土壤顯著改變了土壤銨態氮含量，這是由于生物炭可以提高土壤氮肥利用率，同時，生物炭自身較強的陽離子交換能力對土壤中銨態氮具有強烈的吸附作用從而提高土壤中銨態氮含量[19]。

3.2 生物炭對細菌多樣性的影響

細菌通常以群落的形式存在，細菌群落結構主要指群落中細菌種群的種類和豐度[20]。本研究結果表明，施用生物炭及不同生物炭量較對照對土壤細菌OTU數量和α多樣性指數影響不顯著。這主要是由于生物炭自身結構較穩定，其含有的大量芳香烴不易被分解，對土壤微生物影響較緩慢[21]。有研究指出，生物炭對土壤細菌多樣性的影響效果具有高度的時間依賴性，新應用生物炭時可以短暫提高細菌多樣性和豐度，而隨著時間的推移以及重復添加生物炭對細菌群落影響較小[22]，本研究距初次施用生物炭已過5年，也印證了重復添加生物炭對土壤細菌α多樣性指數影響不大。PCA分析結果顯示，與對照相比，施用生物炭后各處理間細菌群落結構存在差異，且差異隨著施用生物炭量的提高而提高，說明施用生物炭和不同生物炭量間均能影響細菌群落結構組成。結合本研究RDA分析與Mantel text分析結果來看，土壤全氮、銨態氮是影響細菌群落結構的主要因素。生物炭對土壤微生物的影響主要通過改善土壤理化性質以及自身結構為微生物提供生存環境兩方面發揮作用[23]，上述結果中提高生物炭顯著提高了土壤銨態氮含量，說明在氮素用量不變的條件下，生物炭可以通過改善土壤氮素利用率和提高土壤銨態氮含量來影響細菌群落結構。從門水平優勢細菌相對豐度來看，15 t·hm-2處理對優勢細菌相對豐度影響顯著，變形菌門、放線菌門、綠彎菌門的相對豐度顯著提升，酸桿菌門、擬桿菌門的相對豐度顯著降低，這可能是由于不同菌群對生物炭的利用能力以及環境因素造成的，放線菌門可以有效地降解生物炭中復雜的芳香類化合物，從而獲取更多能量生長繁殖[24]。酸桿菌門是嗜酸性細菌，酸性土壤環境有利于酸桿菌門的代謝活動，生物炭作為堿性物質施入土壤可以提高土壤pH，從而抑制了酸桿菌的相對豐度，而酸桿菌門相對豐度降低是土壤質量提高的信號標志[25-26]。變形菌門的豐度變化規律不同，這可能是由于取材的條件差異和植物根際分泌物的影響[27-28]。陳澤斌等[27]的取土部位為根際土，待烤煙成熟期取樣，而本試驗的取土時間為移栽前，根系生長尚不完全，煙草根系分泌物影響不顯著。也可進一步說明，隨著煙株生長，其根系分泌物抑制了變形菌門的生長。綠彎菌門相對豐度提高可以固定土壤碳氮，防止土壤養分流失[29]。結合本研究結果來看，酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門與土壤氮素含量存在顯著相關關系，施用生物炭對優勢細菌相對豐度的影響對土壤質量提升有一定的促進作用。

3.3 生物炭對真菌多樣性的影響

本研究結果表明，施用生物炭及不同生物炭量較對照對土壤真菌OTU數量和α多樣性指數影響不顯著，這與Lucheta等[30]和閻海濤等[31]研究結果一致。真菌在土壤中大多為分解者，對生物炭中頑固性碳利用能力較強[32]，但固性碳性質較穩定，需要一定的時間來分解，結合閻海濤等[31]和Yao 等[33]的研究結果來看，施用生物炭3～5年對土壤真菌α多樣性指數影響不顯著，還需更多的研究結果來驗證生物炭對土壤真菌的影響作用。PCA分析結果顯示，與對照相比，施用生物炭后各處理間真菌群落結構存在差異，低生物炭量對真菌群落結構影響較大，隨著生物炭量的增加，群落結構差異先增大后減小，表明生物炭量對真菌群落的影響在本試驗出來中存在閥值，以致于過高的生物炭量對真菌的影響并不能達到最高。RDA分析與Mantel text分析結果表明，土壤銨態氮含量、速效鉀、土壤容重是影響真菌群落結構的主要因子，這與陳坤等[34]研究結果相近，其中土壤容重作為土壤微生物影響的主要因子報道較少，土壤容重的改善與生物炭的特性密切相關，有助于種子的萌發和植物根系的生長[35]，本研究施用生物炭后土壤容重顯著降低，表明生物炭可以通過降低土壤容重影響真菌微生物群落結構。從門水平優勢真菌相對豐度來看，15 t·hm-2處理顯著提高了子囊菌門的相對豐度，其他處理對優勢真菌相對豐度影響不大，相關性分析結果顯示，子囊菌門與銨態氮、pH呈顯著正相關關系，與土壤容重呈顯著負相關關系，施用生物炭后顯著了提高了土壤銨態氮、pH，降低了土壤容重，有利于提高子囊菌門相對豐度。子囊菌門多為腐生菌，可產生抗生素、有機酸、激素、維生素等有益于作物生長，也對分解植物殘體和降解土壤有機質具有重要作用[36-37]，子囊菌門下的叢赤殼科(Nectricaceae)菌多屬于菌生真菌，可以寄生病原真菌[38]此外還有Incertaesedis 27、毛球殼科(Lasiosphaeriaceae)、假散囊菌科(Pseud-eurotiaceae)可能促進土壤中有機物質分解,從而間接促進植株根系生長[39],說明施入生物炭使子囊菌門豐度升高有利于土壤質量。本試驗中另一優勢真菌被孢霉菌門能分解土壤中的糖類和簡單多糖物質，是土壤中有機質和養分含量豐富的標志類群[13]。總體來說，施用生物炭對優勢真菌相對豐度影響效果并不明顯，表明真菌受生物炭影響效果比細菌小，具體原因還需要今后更深入的研究。