微流控技術在解決豬體外受精中多精入卵問題中的應用進展

劉芊萩, 陳強, 雷安民

(西北農林科技大學動物醫學院， 陜西 楊凌 712100)

近年來，隨著豬在人類生物醫學研究及人類疾病模型中地位不斷上升，胚胎工程技術不但在豬遺傳育種領域的科研應用需求不斷擴大，在生物醫學研究及人類疾病模型領域的需求也更加迫切。鑒于豬體內胚胎研究的高成本，基于豬卵母細胞體外成熟培養(invitromaturation，IVM )、體外受精(invitrofertilization，IVF)、體外胚胎培養(invitroculture，IVC)獲得的低成本體外胚胎成為試驗研究的主要來源。與其他家畜如牛羊不同，豬體外胚胎多精受精率很高，這使得體外胚胎的發育能力大大降低，因此多精受精已經成為醫學生物學利用豬胚胎的一個障礙。多精入卵是指2個或2個以上的精子進入同一卵母細胞的胞質中,導致多倍體合子的形成、早期胚胎發育夭折或發育異常。如今尚不能完全解釋豬體外受精過程中出現的多精受精現象。為此探討豬體外胚胎多精受精的原因，克服豬體外受精中多精入卵的發生成為當前的關鍵問題。

微流控芯片作為新興的生物技術工具，已廣泛應用于小分子分析、核酸分析、蛋白質分析等領域。Kricha等[1]首次采用微流控芯片實現了小鼠的體外受精，證明了微流控芯片在輔助生殖領域的可用性。近年來，微流控芯片在精子優選、卵母細胞培養、體外受精及早期胚胎培養等方面應用廣泛。Clark等[2]首次證明，仿生微通道體外受精系統可以減少豬多精受精，增加胚胎數量，而不降低整體體外生產效率微流控技術的引入，有助于解決豬體外受精過程中多精入卵率較高的問題。本文總結了微流控技術在哺乳動物胚胎學研究中的應用，提出了將微流控技術應用于豬體外受精技術，目的在于解決并克服豬體外受精中存在的多精入卵，旨在為完善豬體外受精技術提供可行的解決方案，同時為人類醫學輔助生殖技術的優化完善提供新思路。

1 多精受精的原因

豬的多精受精現象主要存在于豬體外受精過程中。在實際養豬生產中，豬的窩產仔數可以達到10左右，略低于每個情期的平均排卵數，說明正常發情過程中所排出的卵子大部分都是正常授精的。比對體內自然條件的受精過程與體外受精過程，導致豬體外受精過程中形成多精受精現象主要有3個原因：一是卵母細胞的成熟質量不及體內成熟卵；二是精子的體外獲能不充分；三是體外受精環境不同于體內，導致受精過程出現異常。

1.1 卵母細胞成熟度影響受精過程

除了細胞質內物質積累外，卵母細胞成熟過程中，影響多精子入卵發生的因素主要有透明帶反應、卵黃膜反應等，這些都與卵母細胞的細胞質成熟度相關。

在體外受精過程中，卵母細胞未成熟或過度成熟都會引起多精受精率的升高。皮質顆粒是卵母細胞特有的，用于阻止多精受精的細胞器，哺乳動物的皮質顆粒在未成熟卵母細胞和體外培養卵母細胞中的分布不同于在體內成熟的卵母細胞中的分布[3]，表明皮質顆粒的變化與卵母細胞的質成熟和核成熟有關。未成熟卵母細胞不能產生完整的皮質反應，主要是由于未成熟卵母細胞對精子進入產生的刺激不敏感，且內質網的數目過少，皮質顆粒分布不均勻，精子進入卵母細胞時，不能引起皮質顆粒的釋放。而過度成熟的卵母細胞容易發生老化，會使皮質反應不能發生或反應不徹底，進而引起多精入卵[4]。

透明帶反應是阻止多精入卵的重要環節，當精子進入透明帶后，會引起皮質顆粒的釋放，顆粒內容的釋放引起透明帶結構的改變，進而阻止后續精子的進入。因而，透明帶結構的完整性與透明帶的厚度將直接影響受精過程是否正常。在輔助生殖過程中，過多的人工操作常引起透明帶的機械損傷，會導致多精受精的發生。精卵比例的增大會使受精過程中卵母細胞的皮質顆粒釋放延遲，引起多精受精的產生。研究表明，多精受精率會隨著精卵比的升高而升高[5]，因而篩選出具有優良品質的精子、降低精卵比有助于解決多精入卵的問題。

此外，卵母細胞的成熟質量較差時會使卵母細胞受精過程中發生第二極體滯留，實質是卵母細胞第二極體不能正常排出，從而導致受精卵中2個雌原核和1個雄原核的形成，最終能夠形成多倍體。

1.2 精子原因導致體外受精胚胎的發育不良

由于體外受精不同于體內受精過程中精子在生殖道中的自然選擇，所以相關研究或者臨床應用中，常常采用人工方法對精子進行分選。目前常用的辦法主要有：①常規精子分選技術，主要是指上游法結合離心清洗；②利用不同質量精子表面ζ電位的差異分選精子；③基于細胞流式分選系統的磁激活細胞分選系統；④基于透明質酸結合的精子分選；⑤基于電泳的精子分選；⑥依托運動精子細胞器形態學檢查結果的精子分選；⑦基于微流體的精子分選[6]。

2015年，日本學者采用簡單實用的搖擺受精系統，大大減少了豬體外授精的多精受精現象[7]。這些手段都是基于優良的高活性精子的特性將其從精子群體中分離出來，盡管能夠提高體外受精的效率，但是否能夠減少豬的多精受精現象，仍需進一步研究。

1.3 授精環境導致的多精受精

受精環境中的激素成分、物理條件等也會影響多精受精的產生。受精環境中孕酮水平與卵母細胞成熟狀態密切相關，尤其是雌激素與孕酮的比值直接影響卵母細胞的發育。而黃體酮水平升高會減弱透明帶的硬化程度，影響豬胚胎的形成[8-9]。培養基pH的改變會影響精子獲能和頂體反應的結果，pH升高能夠提高受精率，但會降低皮質顆粒的活力。一些培養基的添加劑如碳酸氫鹽、肝素和咖啡因等，也在不同程度上影響多精受精的發生[10-12]。

2 微流控在胚胎工程中的應用

應用傳統的輔助生殖技術效率低，且體外受精的臨床環節會對母體造成身體傷害、情緒壓力。因此，如何優化、改進卵母細胞和精子以及胚胎的質量評估技術，進而提高體外生殖成功率是推動輔助生殖技術發展的必要條件。

微流體芯片作為新興的生物技術工具，可以對卵母細胞和胚胎等珍貴的細胞樣本進行非侵入性的細胞質量評估，對輔助生殖中的精子樣品進行高通量篩選。與使用培養皿、試管或培養基滴等經典體外方法相比，這些小體積和低雷諾數的芯片更接近授精和胚胎培養的體內環境，這一平臺可以為改善體外受精和胚胎培養提供一種潛在手段。

2.1 微流控芯片在精子質量評估中的應用

輔助生殖技術(assisted reproductive technology，ART)利用精子分選的方法從精液樣本中篩選優質精子。目前使用的常規精子分選技術有密度梯度離心法、直接上游法和常規上游法。但這些方法離心步驟復雜，易產生活性氧，降低DNA完整性并損害精子。新型生物技術，如微流體、電泳、運動精子細胞器形態學檢查和雙折射減少了離心步驟，可以改善精子的篩選過程，獲得完整性更高的DNA、正常形態和運動性的精子，從而改進人工授精結果。

微流控平臺最早被用于改進輔助生殖技術中精子的質量評估環節，微流控平臺特有的收縮性質以及可以創建復雜通道和儲庫網絡的能力是評估運動精子活力的有用組合。早期裝置沒有整合活性流體流動，也沒能在流經微流體通道期間利用流體的獨特物理特性，但它們確實為精子質量評估提供了有潛力、可嘗試的平臺。近些年，隨著設計和制造工藝的進步，微流體在精子優選中的應用也在增加。

微流控裝置通?；谶\動能力和形態對精子進行分選，集成減少了傳統精子篩選步驟。微流體裝置研究表明，回收的精子樣本運動性幾乎達到了100%，同時精子的形態也得到了改善[7]。另一項研究所設計的層流篩選裝置基于精子活力進行篩選，出口處的精子活力從原始樣本的76.21%增加到95.24%[13]。有研究分析了流速和培養基表面形態對精子速度和功能的影響。女性生殖道包含天然微槽和向外流動的液體，有助于將精子引導至卵子[14]，這些微槽和流動的液體有助于篩選出活力良好的精子。有研究模擬女性生殖道的結構設計了一種微流體裝置，該裝置將精子置于一端開口處，通過控制精子向另一端出口的流動，模擬精子在子宮微槽內的運動。結果顯示，80%的精子以3 μL·min-1的流速對抗流動；此外，一旦精子進入微槽，就會被留在凹槽中并直線前進，沒有凹槽的通道中精子傾向于在沒有方向的情況下以曲線游泳，這一信息在將來可用于選擇直線游動的精子[15]。

2.2 微流控芯片在體外胚胎生產中的應用

將微流體技術用于卵母細胞的體外成熟以及早期胚胎的培養時，需要設計可用于培養細胞的微流體裝置。卵母細胞的體外成熟和胚胎培養要考慮的主要問題是如何提高實驗最終的胚胎回收率，雖然在處理數十萬或數百萬個細胞時可以僅回收初始細胞群的一部分，但對于涉及卵母細胞和胚胎的研究，必然要求回收率達到100%。因此，微流控平臺必須使回收過程可控和準確，同時不能改變微流體，有利于細胞培養的特性。此外，應用微流體的額外精力和成本投入必須通過配子或胚胎的顯著收益來抵消，以證明該技術是可行的。目前，微流控平臺已經開始接受胚胎學各個方面的初步測試，包括卵母細胞體外成熟(IVM)，體外受精(IVF)和胚胎培養(IVC)。

2.2.1微流控芯片在卵母細胞成熟中的應用

傳統的體外卵母細胞成熟培養低效且昂貴，而使用微流控芯片進行體外卵母細胞成熟，可以降低成本和降低對卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)等疾病的健康風險。應用于卵母細胞體外培養的第一個微流控裝置，微流體通道兩側是兩個固定的培養基儲庫，結果顯示，裝置中的豬卵母細胞并未達到有效成熟(2% metaphase II， MII)。然而，當這些卵母細胞在PDMS(聚二甲基硅氧烷)裝置中成熟時，與對照微滴相比，它們以明顯更高的速率成熟(分別為2%和相對于MII的71%)[16]。這些研究在不同材料制造的類似設計裝置中進行，最終所得結果差異顯著，表明材料的選擇對敏感的卵母細胞至關重要。

利用微流控通道中液體的可流動性，改進了傳統的靜態培養裝置。一種利用磁力驅動的操縱器結合超聲振動進行單細胞操作的微流體裝置[17]，可以定向移動豬卵母細胞，并且在應用于不同實驗目的時，可以進行程序修改。在此前，振動培養平臺已被證明可以提高豬卵母細胞的發育能力，但這僅適用于體積較大的標準培養皿。因此，如何利用微流體的特性、設計出更接近于體內生殖道環境的培養平臺，模擬體內的機械刺激和液體環境，是優化體外卵母細胞成熟體系的關鍵。

2.2.2微流控芯片在體外受精中的應用 因為精子的獨立運動距離存在闕值，精子運動路徑還可能受到裝置輪廓的影響，而精子的活動特征和精子在裝置中與卵母細胞的相互作用高度依賴于受精環境，體外受精成為了輔助生殖技術中相對困難的步驟。使用微流控芯片固定精子運動路線，限制精子數量，模擬體內受精環境，從而提高受精效率是胚胎仿生學研究的重要目的。

使用置于PDMS(聚二甲基硅氧烷)/硼硅酸鹽微通道中的豬卵母細胞進行人工授精程序步驟，所得結果與對照微滴中的受精結果相比，該裝置顯著降低了多精入卵率，這得益于微流體裝置的物理特性，可以更好地模擬體內環境[2]。同時，該微流體裝置可用于限制卵母細胞暴露于精子的時間，因為精子不再局限于卵母細胞的附近，而是不斷游過卵子。有研究在微流體微孔陣列裝置上進行了受精實驗，與先前的裝置類似，平臺由PDMS制成并且構造有入口和出口儲蓄池，其使用重力產生動力。從每個儲庫引出的微通道連接到更大的微室，其中設有用于捕獲單個卵母細胞的方形微孔，微孔深度可以在保留卵母細胞的同時去除細胞碎片及雜質。培養液和精子可以流過容納卵母細胞的微孔，隨后在其中與卵母細胞發生受精。這種裝置與單孔微流控芯片相比，得到了相似的小鼠卵母細胞受精率(69.0%對71.4%)[18]。來自同一研究組的另一種設備，其設計不同，結合了多個程序步驟，也產生了有利的受精結果[19]。隨著技術的發展，其他微流體裝置還開發了將授精與其他程序步驟相結合的方法。

2.2.3胚胎體外培養 在已經進行的用于優化輔助生殖技術的研究中，微流控芯片在胚胎培養上的應用被證明是有益的。Raty等[20]使用微流體進行胚胎培養的初步報告表明，2細胞小鼠胚胎可以在靜態微量培養基中培養至囊胚階段。與30 μL對照微滴相比，在含有約500 μL培養基的微通道內培養，小鼠胚胎能夠在24 h發育成更大的桑椹胚，在48～72 h形成更大的胚泡，以及在72～96 h產生更多的胚泡。然而，該研究沒有評估對植入的影響。另有學者利用類似裝置進行了后續實驗，結果表明，體內衍生的4細胞豬胚胎可以培養成囊胚，之后進行胚胎移植并成功產出胎兒[21]。

近年來，學者們為了模擬體內環境培養胚胎，還開發了一種采用電介質(electrowetting on dielectric，EWOD)電潤濕技術的新型數字化微流體裝置。結果表明，用EWOD驅動的動態培養可以操作含有一個小鼠胚胎的單個液滴并培養至胚泡期，胚胎孵化胚泡的速率顯著高于傳統靜態培養物(P<0.05)。從EWOD芯片收集胚胎并轉移到假孕雌性小鼠體內，得到了健康胎兒，證明EWOD芯片提高了小鼠胚胎的發育能力[4,22]。

3 利用微流控技術解決多精入卵問題

針對前文所述的豬多精受精原因以及微流控芯片在胚胎體外生產中的應用優勢，微流控技術能夠很好地解決多精受精，原因有三，分別是控制卵母細胞的成熟度、精子的有效分選以及改善體外受精的環境。

3.1 微流控體系提高了卵母細胞的體外成熟質量

應用微流控體系進行卵母細胞的體外成熟，與對照組傳統微滴培養法相比，應用微流控體系以明顯更高的速率成熟(分別為2%和相對于MII的71%)[16]。其次利用微流控通道中液體的可流動性，改進了傳統的靜態培養裝置。牛體外受精的研究顯示，與靜態成熟的卵母細胞相比，在微流控體系成熟的牛卵母細胞受到層流影響，大大改善了IVM后的胚泡發育[17]，卵母細胞成熟質量的提升無疑會大大減少多精入卵的機會。

3.2 微流控體系優化精子的篩選過程

與正常的體內受精相比較，體外受精中精子密度可能是影響多精受精的關鍵。而微流控體系能夠改變受精過程中的精卵比例；維持相對穩定適宜的受精溫度和pH，這些措施可以在一定程度上降低多精入卵率。隨著對豬植入前胚胎發育調控的了解，以及新的分析方法和技術的出現，借助各種新型培養平臺探索外界環境條件改變對胚胎的影響，有助于進一步改善體外受精系統。

在微流控芯片的開發研究過程中發現，微流控裝置設計的通道結構可以產生動態流體的機械刺激，同時模擬體內微環境自分泌因子的分布，在微環境中的培養過程更類似于體內環境，因此能夠更好地模擬精子與卵母細胞所在的生殖腔環境。通過設計與改造，有望消除引起豬體外生殖過程中多精受精產生的因素。同時，利用微流控芯片高通量進行精子篩選，并控制受精環境的精卵比，有助于降低多精入卵率。

利用微流控體系形成的層流效應篩選精子的微流體精子分選儀(microfluidic spermsorter，MFSS)已經被開發出來，可用于豬的IVF。在MFSS-IVF系統中使用公豬稀釋精液進行受精后，正常受精指數(單精受精與初始卵母細胞數量比)比傳統IVF更高，同時裝置中受精卵母細胞的發育能力(胚泡形成能力)高于傳統IVF。總之，在MFSS裝置中的豬卵母細胞與精子的簡短共培養提高了單精子受精的概率和胚胎的發育能力[23]。

4 微流控體系優化體外胚胎的培養

在過去的20年里，改善體外胚胎發育的研究中涉及最多的變量是培養基的化學組成，這一條件的改變有助于減少多精受精，提高輔助生殖的成功率。然而，在解決多精入卵問題的研究中，不僅需要考慮發育中胚胎的化學需求，其潛在的生理需求也是所要考慮的重要因素。卵母細胞和胚胎通過雌性生殖道的過程不僅使其浸泡于化學成分變化的液體，而且還為其提供了溫和的機械刺激，這可能會影響卵母細胞和胚胎的發育。隨著對植入前胚胎的理解得到改進，新的分析方法和技術相繼出現，對于各種新型微流控培養平臺的研究，顯示出物理和機械環境改變可能進一步改善胚胎的體外發育。

4.1 基于靜態培養的傳統培養體系

在過去哺乳動物和非哺乳動物體細胞系、轉化細胞系，配子和胚胎都是被培養在惰性材料中如玻璃或塑料聚合物。在這些細胞培養方法中，除了使用振動平臺或軌道攪拌器的外力振動方式外，所有的培養環境均被認為是靜態的?，F階段，靜態的微流控芯片已經被開發用于胚胎培養，這些靜態培養平臺可以通過簡單地改變培養基的體積和成分，或改變每個培養基的胚胎數量來產生不同的培養環境。

已經在實驗室中使用的商業化產品是一種微孔芯片，這種裝置可以對小鼠、豬和牛等動物的胚胎進行單獨培養。這些隔離的孔相互之間可以產生微流體通道，以達到介質交換，這種連接的插入物可用于研究自分泌和旁分泌化合物對胚胎間的影響。這些微孔可以用PDMS精細地構建，這一結構能夠形成有益胚胎發育的微環境。另外，這些微孔可以使用生物分子材料，例如透明質酸或氫氧化銨涂覆以形成水凝膠表面，這樣更加接近發育中的胚胎在體內的環境[24]。

在靜態培養條件下，微通道也可作為胚胎的培養裝置，在微通道中胚胎可以發育至囊胚階段。研究發現，在微通道培養72和96 h的胚胎分別觀察到囊胚形成和孵化胚泡的發育。使用填充有培養基的玻璃毛細管是進行胚胎的微通道培養研究的另一種方法，這個系統還支持從合子到囊胚階段的小鼠胚胎發育[25-26]。

雖然靜態培養系統已經成功應用于卵母細胞的體外培養，但與體內環境相比，靜態環境無法提供卵母細胞在子宮頸中所受到的擠壓力及變化的液體環境，卵母細胞的成熟狀態還不能得到完全控制。

4.2 基于動態培養的微流控體系

因為植入前胚胎在輸卵管和子宮中的生長階段是進行發育的最終環節，肌肉收縮和上皮細胞纖毛的運動使植入前體內胚胎不斷移動，這會對發育中的胚胎產生機械性影響，這種運動也會改變細胞表面的化學物質梯度，可以形成胚胎周圍環境的動態變化，這證明了動態培養體系的重要性。在靜態培養條件下，由于胚胎分泌物或培養基成分耗竭，培養基中存在著化學濃度的變化，而動態培養平臺可以破壞這些梯度，提供更接近體內生長環境的更均勻的環境。另外，動態的培養系統也為胚胎提供了一個流動的環境，不斷更新培養基質和去除其代謝廢物。通過現代微流控技術可以解決這一問題，該技術可以為細胞創建一個動態的培養環境。

有研究首次描述了使用基于注射器的泵來產生流動培養基的動態胚胎培養方案[27]。微通道位于儲存池的底部，胚胎干細胞可以在微通道中靜止培養以促進它們在注射器泵活化之前的貼壁[28]。通常將諸如胚胎的非粘附細胞移入緊鄰微通道開口的儲庫底部，然后胚胎被動地進入微通道，并沿微通道向下滾動到微通道被半封閉的區域，此處形成屏障并且充當微通道中胚胎的停止點，然后可以使用注射器泵在微通道中固定的胚胎上產生受控流體，Hickman等[29]應用微流控體系使用這種系統來研究小鼠胚胎發育過程中微通道中流體流動的變化，研究開始強調流速、流動方式和胚胎周圍流體動力的交互作用。

2007年，名為“子宮芯片”的微流控裝置被開發制作，該裝置將子宮內膜細胞與胚胎共培養在一個聯通裝置中。這種先進的系統已經被用來改善小鼠胚胎發育[30-31]。之后一種新的微流控裝置被開發，用于對小鼠卵母細胞進行體外培養，并對成熟情況進行評價，該裝置主要評估卵母細胞受精至囊胚期的發育情況及其谷胱甘肽含量。結果顯示，被動和主動動態培養系統中，成熟中期Ⅱ期卵母細胞(MII)的百分率明顯高于靜態組，被動組和主動動態組的生發泡(GV)和退化卵母細胞的平均數目明顯少于靜態組，同時動態成熟卵母細胞中谷胱甘肽含量顯著高于靜態成熟卵母細胞[32]。研究顯示，體外卵母細胞成熟的動態培養與靜態培養條件相比，提高了卵母細胞的發育能力。

使用微流控裝置也可以實現在大型微孔陣列中高效捕獲單細胞的目的，當前生物測定大多數是基于大細胞群體，其在多細胞反應的過程中會失去重要的時間數據。這種捕獲裝置不依賴于細胞粘附，并且不需要龐大或昂貴的器具來將細胞保持在微孔中[33]。這一裝置為之后的單個卵母細胞處理提供了操作基礎，也可以進一步降低精卵比例，控制接觸卵母細胞的精子數量。

動態培養系統的研究為解決多精入卵問題提供了新的方向，卵母細胞成熟過程中不同階段所需的不同化學因子可以通過動態系統精確控制，注射泵及層流效應使卵母細胞所受外力更接近于體內。而光學儀器與芯片的結合實現了卵母細胞的成熟過程及發育情況的全程監控，從而可以選擇最優成熟時期進行受精操作，有助于解決由于卵母細胞不完全成熟導致的多精入卵情況。

5 展望

微流控所具有的明顯優勢使其成為改良輔助生殖技術的潛在手段，其操作規模小，只需要少量的精子樣本用于受精，而不會造成大量精子的浪費。同時該技術與生物光學的結合可以做到非侵入性的精子質量檢測，減少篩選過程中的損失。微流控芯片采用的計算自動控制機程序可以實現不同時段胚胎發育情況的監測和顯示，通過連續成像有助于進一步確認胚胎發育潛能。通過實現動態培養、胚胎單個捕獲等操作，微流控芯片還為可能進行的卵母細胞后續處理提供了操作基礎。該平臺接近于體內受精與胚胎培養環境，并能方便地控制微觀條件下的培養，為研究人員解決豬體外受精中出現的多精入卵現象提供了更多研究可能。

豬體外受精中的多精受精一直是相關領域的研究難點，借助微流控技術提供的實時精準監控評測技術，可能幫助解開豬多精受精的原因所在，為將來利用豬進行相關研究提供便利。但基于微流控技術的精子篩選及胚胎培養無法對大量樣本進行操作，對于需要大量材料的實驗，仍只能使用傳統方法。同時微流控平臺的復雜操作需要高度專業化的人員，在臨床環境中對于設備操作和結果分析仍有許多限制因素，因而大多數微流體裝置仍停留在臨床試驗階段，在獲得對ART影響結果前需要更多的信息，尚有許多困難等待解決，廣泛應用仍需時日。