無創產前基因檢測在血清學篩查風險值異常及高齡孕婦中的應用*

景亞玲， 劉曉芳,2， 陳儉輝， 趙連芳**， 趙詠梅

(1.遂寧市中心醫院 產前診斷中心實驗室， 四川 遂寧 629000； 2.遂寧市中心醫院 產科， 四川 遂寧 629000)

有研究報道，胎兒染色體異常占出生缺陷遺傳學病因的80%以上，常見類型有21-三體(唐氏綜合征)、18-三體(愛德華綜合征)及性染色體異常等，此類患兒大都伴有輕中度、甚至嚴重的智力障礙或結構畸形[1-2]，目前尚無有效的方法治療該病，只能通過產前檢查盡早發現并及時終止妊娠來避免胎兒的出生。血清學篩查可以從一般孕婦人群中篩查出胎兒罹患18-三體或21-三體風險較高的孕婦[3]，而高齡孕婦由于其卵細胞質量下降、生殖功能減退、生殖細胞或受精卵易發生染色體畸變或不分離等，導致胎兒染色體異常發生率較高，此類孕婦大多行羊水穿刺分析胎兒染色體核型，但羊水穿刺屬于有創檢測技術，存在誤傷胎兒、致畸、流產、宮內感染等風險[4]。無創產前基因檢測(non-invasive prenatal testing，NIPT)由于簡便、無創，并且對21、18、13號等染色體非整倍體異常的篩查具有較高的靈敏度、特異性及陽性預測值，越來越多的孕婦選擇先行NIPT檢測，如果NIPT陽性者再行介入性產前診斷[5]。本文旨在通過比較孕婦先行NIPT檢測(陽性者再行羊水穿刺)與直接行羊水穿刺間的胎兒染色體異常檢出情況，探討NIPT檢測在血清學篩查風險值異常孕婦及高齡孕婦中的臨床應用價值。現報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

統計2018年1月—2019年12月接受遺傳咨詢的血清學篩查風險值異常及高齡的單胎孕婦檢查的情況，以自愿選擇先行NIPT檢測、結果異常者再行羊水穿刺進行胎兒染色體核型分析的孕婦作為NIPT組，以直接選擇羊水穿刺進行胎兒核型分析的血清學篩查風險值異常孕婦及高齡孕婦作為羊水穿刺組。血清學篩查風險值異常包括：血清學篩查臨界風險、21-三體(T21)高風險及18-三體(T18)高風險，設定T21和T18高風險切割值(Cut Off)分別為1 ∶270和1 ∶350，大于Cut off值為高風險，風險值在Cut off 值到1 ∶1 000 的孕婦為臨界風險。孕婦預產期年齡≥35歲的歸為高齡孕婦。所有檢查者均嚴格簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1無創產前檢測方法及診斷標準 采集孕婦靜脈血10 mL，離心分離血漿、提取血漿游離DNA、構建文庫、文庫定量、BerryGenomics/Illumina NextSeq CN 500高通量測序機測序及數據分析，計算出13、18、21三條染色體和其它染色體Z值[6-7]。利用Z值評估樣本的風險值，Z為-3<～<3判定為非整倍體低風險， ≥3判定為非整倍體高風險；NIPT結果提示異常者行羊水穿刺及胎兒核型分析，對NIPT低風險孕婦詳細解釋檢測結果及意義。

1.2.2羊水穿刺及核型分析 在無菌條件下，超聲引導定位抽取羊水20 mL，均分為2管，1 800 r/min 離心12 min，留取細胞懸液1.5 mL，采用平行法雙線，分別接種于加有GBICO培養基3 mL的2個培養瓶中，置于37℃培養箱培養7 d、換液、轉種，10 d左右根據細胞生長情況收取細胞。經秋水仙堿終止羊水細胞生長、物理法刮取羊水細胞、低滲、預固定、固定、再固定、滴片、烤片、胰酶消化及 Giemsa 染色制備羊水染色體片，經蔡司 Axio Imager Z2 全自動染色體掃描分析儀掃片，每個標本至少分析8個核型，計數30個分裂相，有異常核型需增加分析和計數的個數。根據《人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN2016)》對所檢染色體進行命名，本研究未統計染色體正常變異的核型結果。

1.2.3對妊娠或新生兒結局進行隨訪 采用多種方式對所有研究對象妊娠或新生兒結局進行隨訪。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 染色體異常檢出情況

結果顯示，NIPT組共納入1 198例，包括血清學篩查臨界風險546例、21-三體高風險160例、18-三體高風險5例及高齡孕婦487例；其中17例NIPT提示異常，經羊水穿刺后確診胎兒染色體核型(表1)；羊水穿刺組共納入1 253例，包括血清學篩查臨界風險105例、21-三體高風險515例、18-三體高風險65例及高齡孕婦568例，其中33例核型異常(表2)。

表1 NIPT組17例NIPT異常的胎兒染色體核型及妊娠結局Tab.1 The karyotype and pregnancy outcome of 17 fetuses with abnormal NIPT in NIPT group

表2 羊水穿刺組33例核型異常胎兒的穿刺孕周、檢查指征及染色體核型Tab.2 Gestational age at puncture, examination correction, and chromosome karyotypes of 33 cases of fetus with abnormal karyotype in amniocentesis group

2.2 隨訪及染色體異常檢出率

結果顯示，NIPT 低風險的孕婦，其胎兒出生3個月后的隨訪暫未發現異常病例；在血清學篩查臨界風險、21-三體高風險、18-三體高風及高齡指征2組孕婦的染色體異常檢出率比較，差異均無統計學意義(P> 0.05)。見表3。

表3 NIPT組與羊水穿刺組的染色體異常檢出率Tab.3 Comparison of the detection rates between NIPT and amniocentesis groups

3 討論

血清學篩查風險值異常不僅可以提示懷有18-三體或21-三體胎兒的風險增高，還可以提示開放性神經缺陷、宮內發育遲緩和流產等的風險增加[8-9]；由于婚育觀念的改變和計劃生育政策的變化，我國高齡孕婦明顯增多[10]，而高齡會導致胎兒染色體異常發生率增高[11]，所以臨床工作中要注意這兩大類群體的進一步產前檢查。當臨床醫生建議臨界風險孕婦先行 NIPT 檢測異常者再行羊水穿刺，血清學篩查高風險孕婦及高齡孕婦直接行羊水穿刺術，孕婦出于緊張、焦慮和恐懼等自身原因，會出現臨界風險孕婦愿意直接做羊水穿刺確診胎兒染色體，但也有血清學篩查高風險孕婦和高齡孕婦不愿或有介入性產前診斷禁忌癥而不適行羊水穿刺術的情況。

血清學篩查臨界風險孕婦為 NIPT 的適用人群[12]。在充分知情同意情況下，本研究的651名臨界風險孕婦中，567名孕婦選擇先行 NIPT，只有7名孕婦NIPT提示異常(1.23%)需要接受侵入性產前診斷。由于孕周不適宜再等待、想要準確率更高的檢測、追求“一步到位”等多種原因，另外的105名(16.13%)臨界風險孕婦選擇直接行羊水穿刺確診胎兒染色體核型，最終檢出21-三體2例(1.90%)，在臨界風險孕婦的 NIPT 組與羊水穿刺組的檢出率差異無統計學意義(P>0.05)，表明對于臨界風險孕婦先行 NIPT 檢查可以顯著減少孕婦接受有創性產前診斷的例數。

研究表明血清學篩查高風險可以提示21三體和18-三體以外的其他多種染色體異常，如環狀染色體、易位染色體等[13-15]，所以血清學篩查高危孕婦如果僅行 NIPT 檢測而不行羊水穿刺，可能會存在漏診除染色體數目異常外的其它染色體異常類型的風險[12]。本研究有160名21-三體高風險孕婦及5名18-三體高風險孕婦選擇先行 NIPT，只有1例提示性染色體異常，后經羊水穿刺診斷為45,X；其余515名21-三體高風險孕婦和65名18-三體高風險孕婦孕婦選擇直接羊水穿刺，檢出19例孕婦胎兒染色體有異常。且在2種高風險孕婦的 NIPT 組與羊水穿刺組的檢出率間差異均無統計學意義(P> 0.05)，表明 NIPT 在血清學篩查高風險人群已具有十分良好的表現，NIPT 可以降低由于篩查高風險而接受介入性產前診斷病例數量、減輕產前診斷的工作量等[16-17]。

高齡孕婦胎兒多較為珍貴，由于介入性產前診斷存在重新穿刺、宮內感染和流產等風險，所以高齡孕婦對介入性產前診斷的依從性并不高。本研究中有487名(46.16%)高齡孕婦共選擇先行 NIPT，9例NIPT提示異常，經穿刺后檢出6例胎兒染色體有異常，其中1例核型分析結果為47,XXY 的高齡孕婦由于懷孕困難，選擇繼續妊娠，新生兒生殖器異常。其余568名(53.84%)高齡孕婦選擇直接行羊水穿刺，檢出12例胎兒染色體有異常。在高齡指征中NIPT 組與羊水穿刺組的檢出率間差異無統計學意義(P>0.05)，表明 NIPT 在高齡孕婦中也具有十分良好的表現。

在1 198例的NIPT組中，共有17例 NIPT 提示異常。其中1例提示17號染色體增加高風險，經羊水穿刺確診為17號染色體三體嵌合體，該孕婦拒絕進一步檢查，孕期超聲監測未發現異常，后足月分娩，外周血核型正常、未見嵌合體，隨訪時孩子已經7個月，生長發育未見異常，主要考慮胎盤嵌合體、母體細胞污染、羊水培養細胞分化出畸形克隆和實驗誤差等原因導致的假性嵌合，所以當產前診斷檢測出嵌合體時，應采用染色體微陣列技術(chromosomal microarray analysis，CMA)、熒光原位雜交技術(fluorescence in situ hybridization，FISH)和胎兒臍帶血核型等方法驗證，并結合 B 超等結果，提供科學準確的信息，減少正常胎兒的丟失[18]。本研究發現7例 NIPT 假陽性，NIPT 假陽性的可能原因是胎兒/胎盤嵌合體、雙胎之一胎死宮內、母體嵌合體、母源性拷貝數變異、母源性惡性腫瘤，而性染色體由于 X 染色體含有較多的 GC 堿基和失活現象以及與 Y 染色體標記序列的相似性等原因導致檢測準確率較低[12,14,16,19]。NIPT 檢測也會出現假陰性的現象[16,20]。因此，要科學對待和處理 NIPT 結果，當NIPT提示異常時應當進行產前診斷以避免由于假陽性引起正常胎兒被引產，當 NIPT 陰性時應加強后期B超等監測，避免由于假陰性導致嚴重的染色體病患兒的出生，從而最大程度地達到優生的目的[21]。

在1 253例的羊穿組中，發現33例染色體異常，其中有9例胎兒染色體異常結果若孕婦選擇先行 NIPT 檢查可能無法檢出，包括1例12-三體嵌合體、1例重復、4例平衡易位、2例羅伯遜易位和1例倒位，因此，臨床醫生有義務告知孕婦 NIPT 的局限性。遺傳咨詢后建議12號染色體三體嵌合體的孕婦進一步檢查驗證是否為假性嵌合體的干擾，但該孕婦拒絕進一步檢查，選擇終止妊娠。9q21 區段重復的胎兒核型，經追溯與其母親核型一致，孕期超聲監測未發現異常，在充分告知胎兒可能會出現的情況后，該孕婦選擇繼續妊娠，隨訪至孩子1歲，生長發育未見異常。染色體異常攜帶者在減數分裂過程中會產生不平衡配子，可能會有不孕不育、自然流產和染色體異常患兒的出生等風險[22-23]。在充分告知胎兒可能會出現的異常情況后，本研究中的7例染色體異常攜帶者的孕婦均選擇繼續妊娠，且新生兒未見異常。

綜上所述，血清學篩查風險值異常可以提示除18-三體和21-三體以外的其他染色體異常，而高齡孕婦的年齡越大，胎兒染色體異常發生率越高。本研究表明 NIPT 檢測可作為產前診斷技術有效的輔助篩查方法，對于不愿或無法接受產前診斷的血清學篩查風險值異常孕婦和高齡孕婦能夠最大限度的降低不行產前診斷的風險。