云南木瓜紫米酒活性成分含量的測定分析

（墨江地道酒業有限公司，云南普洱 654800）

地道云南木瓜紫米酒是以墨江縣優質紫米釀制而成的優質白酒為基礎酒，加以切片后木瓜浸泡、貯存、過濾、調配等一系列工藝配制而成。按產品分類屬于配制酒[1]。墨江紫米營養豐富，有補血、健脾、理氣等藥用價值[2]，木瓜具有滋補健胃、舒筋活絡等功效[3]。配制酒的保健功能和獨特風味越來越受消費者的喜愛，因此，本研究旨在綜合開發利用墨江紫米和木瓜，并按蒸餾酒及其配制酒生產衛生規范[4]進行了3 批次的木瓜紫米酒預生產調試試驗，并擬對其產品進行質量控制研究。目前針對配制酒的活性成分研究主要以揮發性成分研究報道較多[5]，浸泡物成分的研究仍有研究空間。本研究以木瓜中的蘆丁、綠原酸、槲皮素、沒食子酸、水楊酸為指標成分[6-7]，參考惠小娜等[8]的研究方法，建立了以UPLC-MS/MS 法測定了新產品地道云南木瓜紫米酒中蘆丁、綠原酸、槲皮素、沒食子酸、水楊酸的含量，以期為該產品的標準制定和質量控制提供參考、為該產品開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料

酒樣：3批地道云南木瓜紫米酒（均為開發研究試制產品，廠家：墨江地道酒業有限公司，批號：20181110A、20190315A、20190412A）。

1.1.2 試劑

試劑及耗材：水楊酸對照品（批號：110742-201220，純度：99.1 %）、綠原酸對照品（批號：110753-201716，純度：99.3%）、蘆丁對照品（批號：100080-201610，純度：91.9 %）、沒食子酸對照品（批號：110831-201605，純度：90.8 %）均購自中國食品藥品檢定研究院，槲皮素對照品（批號：100081-200907，純度：96.5 %）購自中國食品藥品檢定所；甲醇（色譜純，美國Fisher 公司），甲酸（色譜純，美國Tedia 公司），實驗室用水為Mili-Q 超純水（德國Merck 公司）。

1.1.3 儀器設備

1290 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司），G6430 三重串聯四級桿質譜儀（美國Agilent 公司），XS205DU 十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler 公司），3-18KS 高速臺式冷凍離心機（德國SIGMA 公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 對照品溶液制備

精密稱取蘆丁、綠原酸、槲皮素、沒食子酸、水楊酸對照品適量，加50%甲醇分別制成0.937 mg/mL、1.095mg/mL、0.975mg/mL、1.082mg/mL、1.105mg/mL、1.079 mg/mL、0.822 mg/mL、1.002 mg/mL、1.061 mg/mL貯備液。分別取各對照品溶液適量，置于同一100 mL容量瓶中，用50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得蘆丁、綠原酸、槲皮素、沒食子酸、水楊酸的混合對照品溶液，質量濃度分別為1.950 μg/mL、31.11 μg/mL、0.2120 μg/mL、2.190 μg/mL、1.914 μg/mL。

1.2.2 供試品溶液制備

取地道云南木瓜紫米酒適量于PE 管中，置離心機中，10000 r/min 離心10 min 后，取上清液經0.22 μm的微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

1.2.3 空白樣品溶液

取紫米酒基酒，按“1.2.2”方法制備空白樣品溶液。

1.2.4 儀器測試條件

色譜條件：Agilent SC-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm,1.8 μm）；流動相：水（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min，10 %B；3～4 min，10%→30%B；4～5 min；30%→50%B；5～7 min，50 %→70 % B；7～10 min，90 % B；10～11 min，90%→10%B），流速為0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

質譜條件：采用電噴霧負離子電離源模式（Electronic spray ion,ESI-），掃描方式為多反應監測（multiple reaction monitoring,MRM），霧化氣壓力：30 psi，干燥氣溫度：300 ℃，干燥氣流速：9 L/min，毛細管電壓為3500 V，MRM 模式定量。5 種活性成分的電離方式、分子量、母離子、子離子、錐孔電壓、碰撞能量等質譜參數見表1。

2 結果與分析

2.1 色譜和質譜條件優化

本試驗考察了甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、0.1 % 甲酸乙腈-水等流動相條件，發現0.1%甲酸乙腈-水條件下各組分均可以得到較好的分離和峰形；質譜條件進行優化發現，ESI 負離子掃描模式下5 種活性成分響應值均優于ESI 正離子模式，因此本試驗選擇在ESI 負離子掃描模式下確定各成分母離子及其解簇電壓（DP），然后找出特定子離子，優化得到最佳碰撞能（CE），最后在MRM 模式下優化各成分的質譜參數，優化所得質譜條件使各成分均顯示出較高的檢測靈敏度。優化所得5 種活性成分UPLC-MS/MS 色譜圖分離度良好、峰形均較好、空白樣品無干擾。結果見圖1。

表1 5種待測活性成分質譜條件

2.2 線性關系、定量限和檢測限

精密量取“1.2.1”項下混合對照品溶液適量，采用倍數稀釋法，用50%甲醇分別稀釋2 倍、5 倍、10倍、20 倍、100 倍、200 倍，制得6 個不同濃度梯度的系列溶液，按“1.2.4”項條件下分別進樣測定3 次，記錄峰面積。以對照品待測液濃度（x）為橫坐標，峰面積平均值（y）為縱坐標，進行回歸，再將混合對照品溶液逐步稀釋，分別以信噪比S/N=10、S/N=3 時的質量濃度作為定量限和檢測限，結果見表2，各成分在各自范圍內線性關系良好。由檢出限和定量限結果可以看出，本方法靈敏度較高。

2.3 穩定性試驗

取同一供試品溶液（批號20181110A），于室溫下放置0、2 h、6 h、12 h、24 h 后在“1.2.4”項條件下進樣測定，根據蘆丁、綠原酸、槲皮素、沒食子酸、水楊酸色譜峰面積計算RSD，分別為2.37%、0.66%、2.78 %、2.23 %、1.16 %。結果表明，該供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.4 重復性試驗

圖1 多反應監測模式下5種活性成分UPLC-MS/MS色譜圖

表2 5種成分的回歸方程、線性范圍、相關系數、LOQ 和LOD

取同一批樣品（20181110A），按“1.1.2”方法制備供試品溶液6 份，在“1.2.4”項條件下進樣測定，測得地道云南木瓜紫米酒中蘆丁、綠原酸、槲皮素、沒食子酸、水楊酸含有量計算RSD，分別為1.31%、1.18%、3.46%、2.26%、1.33%。結果表明，該方法重復性良好。

2.5 加樣回收率和精密度試驗

分別精密取0.1 mL 混合對照品溶液各6 份，于40 ℃氮氣吹干，分別精密加入同批次含有量已知的地道云南木瓜紫米酒（20181110A）10 mL，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，在“1.2.4”項條件下進樣測定，計算回收率和精密度。5 種活性成分的平均回收率分別為蘆丁99.8 %、綠原酸95.6 %、槲皮素102.4 %、沒食子酸101.2 %、水楊酸104.3 %，結果均在95.6 %～104.3 %。結果表明，該方法回收率良好，可用于準確測量；RSD 分別為2.31 %、2.87 %、4.69 %、3.12 %、2.96 %，均在2.31 %～4.69%。結果表明，該方法精密度良好。

2.6 樣品含有量測定

取不同批號地道云南木瓜紫米酒3 批，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，在“1.2.4”項條件下進樣測定，計算含有量，結果見表3。所測3 批地道云南木瓜紫米酒試制產品中，綠原酸含量最高，各批次間5 個成分的RSD 在0.94%～8.92%，各批次各成分含量較穩定。

3 結論

地道云南木瓜紫米酒豐富了墨江紫米和木瓜的精深加工產品，對推動墨江紫米產業的發展有促進作用，并可給當地帶來一定的經濟效益。本試驗經方法學考察驗證，建立了UPLC-MS/MS 法同時測定地道云南木瓜紫米酒中蘆丁、綠原酸、槲皮素、沒食子酸、水楊酸的含有量，該方法簡便快速、專屬性強、靈敏度高，為地道云南木瓜紫米酒質量控制及產品質量標準的制定奠定基礎，為進一步開發利用該產品提供了理論依據。

表3 樣品測定結果(μ g/L，n=3)