白細胞介素-6在大鼠肝肺綜合征發病機制中的作用

王立國 郭月寧 劉喃喃

肝肺綜合征(hepatopulmonmy syndrome HPS)是在慢性肝病基礎上形成的以肺微血管擴張、低氧血癥為主要特征的一種疾病，是終末期肝硬化患者最嚴重的并發癥，成人終末期肝病患病率為4%～47%，發病機制未完全闡明，治療效果差，病死率高[1-2]。目前多數研究認為，低氧血癥是HPS發病的重要原因，高壓氧可治療大鼠HPS[3]。低氧血癥的病理生理基礎是肺微血管擴張[4]。引起肺微血管擴張的因素很多，目前研究主要集中在血管活性物質方面，如一氧化氮(nitric oxide,NO)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factors,TNF-α)、一氧化碳(carbon monoxide,CO)等，通過不同途徑促進肺微血管內皮細胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVEC)增殖，引起細胞通透性增強，從而導致肺微血管擴張而產生低氧血癥。

研究表明，白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)在免疫調節、造血、炎癥與腫瘤發生方面具有廣泛生物學活性，其可以聯合WBC及NLR值作為評估慢加急性肝衰竭患者早期預警指標[4-6]。細胞因子多數通過結合特定受體并激活一些信號轉導通路而發揮調控作用。IL-6/JAK2/STAT3信號通路是一條重要的轉導通路，被廣泛報道參與到細胞增殖過程中，在細胞周期、細胞增殖領域中具有良好的研究基礎。本實驗通過建立大鼠HPS模型，體外分離培養PMVEC，研究IL-6對肺微血管細胞增殖的作用，并闡明IL-6/JAK2/STAT3信號通路在HPS發病機制中的重要意義。

資料與方法

一、動物、儀器和試劑

Wistar大鼠40只，體質量為180～ 250 g[實驗動物生產許可證編號：SCXK(魯)20130001]；PCR儀購置ABI Biosystems公司，型號ABI7000；流式細胞儀購置美國BD公司，型號FAC-Scan；超聲采用加拿大Sonix OP診斷系統；低糖DMEM培養基為美國PAA公司；植物凝集素購于美國Sigma公司；RT-PCR相關試劑及抗體購自美國Thermo公司；蛋白質印跡相關試劑及抗體購置于美國Cell Signaling公司和武漢博士德生物技術有限公司等；部分MTT溶液等按標準步驟配制而成。

二、動物模型制備

采用隨機數字表法將大鼠分為實驗組和對照組，每組20只，實驗組采用膽總管結扎法建立大鼠HPS模型，而對照組僅開腹并分離膽總管，無其他處置。術前禁食8 h，4%水合氯醛1 mL/100 g腹腔內注射麻醉，固定操作臺，沿腹白線開腹，于胃竇尋找十二指腸降段，找到并分離膽總管，用4-0線在膽總管末端雙線結扎后關腹。術后分籠飼養，觀察大鼠皮膚光澤色澤、排尿顏色、精神狀態等，并檢測動脈血氧分壓及NO濃度來驗證造模是否成功。腹部超聲觀察膽總管擴張情況。HPS模型大鼠處死，取出肝臟及肺臟組織10%甲醛固定，包埋蠟塊并切片H-E染色，觀察肝臟纖維化及假小葉形成情況，以及肺臟微血管擴張表現。

三、大鼠PMVEC分離與培養

組織塊法培養原代PMVEC，在低糖DMEM培養基中加入肝素，采用植物凝集素BSI結合實驗鑒定培養的細胞是否為PMVEC。

四、血漿相關指標檢測

RT-PCR方法檢測IL-6 mRNA表達，引物IL-6(509bp)：F-GAC TGA TGT TGT TGA CAG CCA CTG C;R-TAC CCA CTC CTT CTG TGA CTC TAA CT, 反應條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，63 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，33個循環72 ℃ 7 min，所用試劑盒為美國Thermo公司；ELISA法按照試劑盒說明書檢測IL-6蛋白水平；MTT和流式細胞術分別檢測PMVECs增殖和凋亡情況；蛋白質印跡方法測定pJAK和pSTAT的蛋白表達。

五、統計學處理

結 果

一、大鼠HPS動物模型建立成功

在膽總管結扎術后4～6周，動物肝硬化形成，部分并發HPS。術后3 d，大鼠精神萎靡，膚色及尿液變黃，一般狀態差，動脈血氣氧分壓下降，血漿NO水平升高，2周后更加明顯，4周后超聲見膽總管擴張。4～6周將大鼠處死觀察，膽總管明顯擴張、肝臟表面見纖維條索瘢痕，病理示肝臟假小葉形成(圖1)及肺微血管擴張(圖2)，表明大鼠HPS建模成功。

圖1 肝病理組織學變化 術后4周肝臟炎細胞浸潤、結締組織增生部分假小葉形成(H-E，400X)

圖2 肺組織病理學變化 術后6周肺微血管擴張，并見少量紅細胞位于肺泡腔

二、 IL-6在大鼠HPS模型中的表達水平

對比常用炎癥細胞因子，如TNF-α、IL-8、IL-1和IL-6，通過實時定量PCR方法發現IL-6的mRNA水平明顯高于對照組，P<0.05,差異有統計學意義；ELISA方法檢測IL-6蛋白水平，結果表明其IL-6水平明顯高于其它組。表明IL-6的表達水平在大鼠HPS模型中顯著增加。

三、IL-6促進了PMVEC的增殖水平以及抑制了脂多糖所誘導的細胞凋亡

IL-6作用于體外分離培養的PMVEC，通過MTT方法檢測其細胞增殖情況，結果顯示，PMVECs在96孔板中以2 000個細胞每孔的密度培養1,3,5或7天，IL-6組和非IL-6組相比，IL-6促進了PMVEC增殖水平；我們對PMVEC進行脂多糖處理，并且加入或者不加入IL-6，以200 000個細胞每孔的密度培養12 h，然后通過流式細胞術的方法對細胞凋亡進行檢測。結果顯示IL-6對于脂多糖所誘導的PMVEC的凋亡現象具有明顯的降低效應。

四、IL-6可以激活PMVEC的JAK2/STAT3信號通路

PMVECs進行IL-6處理，12 h后通過Western Blot的方法對JAK的磷酸化水平進行檢測。PMVEC被IL-6處理12 h后，JAK2的磷酸化水平顯著性地增加了，而同一時間，JAK1和JAK3的mRNA水平在這些實驗組的PMVEC中卻沒有明顯的變化。

五、JAK表達的下降抑制了PMVEC的增殖以及誘導了IL-6所激活的細胞凋亡

我們對PMVECs進行JAK2的敲除，然后通過MTT實驗來檢測細胞增殖水平。結果顯示JAK2的mRNA水平被RNAi所顯著性地敲除，而STAT3也是處于沒有被激活的狀態，當PMVEC被IL-6所處理后，下調表達的JAK2可以抑制細胞增殖的水平。通過流式細胞術的方法檢測了細胞周期的水平，結果顯示在JAK2被敲除后，G1/G0期的比例明顯增加了，而S期以及G2/M期的水平顯著性地降低了。同時我們對PMVEC進行STAT3的敲除。結果顯示在對細胞進行STAT3的siRNA的轉染后，PMVEC的STAT3處于沒有被激活的狀態。因而，我們的結果顯示STAT3可以促進PMVEC的增殖，細胞周期的進程，以及抑制細胞凋亡。

討 論

HPS病因不清，發病機制復雜，目前認為肺微血管擴張及低氧血癥參與其發生過程。多數學者認為PMVECs增殖和新生血管的形成在HPS發病機制中作用明顯[7]。其促發因素包括多種血管活性物質和細胞因子，如NO、CO、TNF-α等，近些年來IL-6的作用得到重視，其參與多種細胞病理生理活動，如細胞增殖、分化等。

HPS的研究多數基于動物實驗，因此動物模型的成功建立尤為重要，目前普遍認為膽總管結扎術式建模成功率高[8]，我們的實驗也證明了這一點。在HPS模型判斷上我們的創新之處是在術前和術后分別給予大鼠行超聲波檢查，判斷膽總管寬度，之后再行動脈血氣分析和血漿NO水平測定，這樣可更準確判斷模型建立。

目前研究認為多種血管活性物質及細胞因子參與到了PMVECs的增殖及微血管擴張中，并促進了HPS的發生[9]。其中NO是目前公認的擴血管物質，通過PMVECs產生的內皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性增加，參與HPS的形成與發展[10]。而HPS形成時因腸黏膜屏障影響形成腸源性內毒素血癥，內毒素可刺激炎癥相關細胞因子的產生，如TNF-α、IL-1、IL-6等，促進NO產生并舒張肺血管[11]，從而引起HPS發生。本實驗也證明了這一觀點。我們通過實時定量PCR的方法在大鼠HPS模型中測定多種炎癥細胞因子，包括TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8，結果發現IL-6的mRNA水平較對照組明顯升高，差異具有統計學意義。我們將PMVEC進行體外培養，采用ELISA方法檢測IL-6的蛋白水平，結果得出與mRNA一致的現象，以上結果表明IL-6的表達水平在大鼠HPS模型中顯著增加。

既往研究認為部分細胞因子參與PMVEC的增殖，促進了新生肺血管的形成，那么IL-6是否具有這些特征呢？筆者通過實驗進一步研究了IL-6對PMVEC增殖的影響。體外分離培養了PMVEC，將IL-6作用于該細胞，采用MTT方法對細胞增殖進行檢測，結果表明，IL-6促進了PMVEC的增殖；同時采用脂多糖誘導了PMVEC凋亡，通過兩組(加IL-6組和不加IL-6組)對比研究，采用流式細胞術的方法進行細胞凋亡檢測，結果表明IL-6對脂多糖誘導的PMVEC的凋亡現象具有明顯的降低效應。因此，筆者認為IL-6具有促進PMVEC增殖并抑制細胞凋亡的作用。

眾所周知，細胞因子是通過特定細胞傳導通路而發揮調控作用，而目前國際上對于IL-6/JAK/STAT這一信號通路研究較多，在炎癥、腫瘤、細胞增殖及凋亡中被廣泛報道[12-14]。在細胞周期、細胞增殖領域中具有良好的研究基礎，筆者的實驗也進一步研究證明了IL-6對細胞增殖的影響是通過激活JAK2/STAT3信號轉導通路實現的。我們對PMVEC進行IL-6的處理，12 h后通過Western Blot的方法對JAK的磷酸化水平進行檢測。當PMVEC被IL-6處理12 h后，JAK2的磷酸化水平顯著性地增加了，而同一時間，JAK1和JAK3的mRNA水平在這些實驗組的肺臟微血管內皮細胞中卻沒有明顯的變化。同時對PMVECs進行JAK2的敲除，然后通過MTT實驗和流式細胞來檢測細胞增殖及凋亡水平，結果表明STAT3可以促進PMVEC的增殖，細胞周期的進程，以及抑制細胞凋亡。研究證明，IL-6/JAK2/STAT3信號轉導通路參與了PMVEC的增殖調控中，促進了HPS的形成。

綜上所述，HPS發病機制復雜，對其基礎研究經驗主要來源于動物實驗。HPS的膽總管結扎模型成功率高，但需注重幾個細節。IL-6在HPS發生發展過程中起到重要作用，具有促進PMVEC增殖及抑制凋亡作用，其發生作用的關鍵信號轉導通路為JAK2/STAT3途徑。我們的發現為更好地認識HPS的病理機制提供了理論基礎，但IL-6在HPS中研究較少，作用機制復雜，需要有更多的實驗去論證與支持。