不明原因肝病生物樣本庫的建立與管理

宋金云 趙宏宇

隨著醫療技術的發展以及乙型肝炎疫苗的普及，傳染性肝病的發病率逐漸下降，而不明原因肝病患者呈增多趨勢?！安幻髟蚋尾　笔侵笩o誘因的持續或反復肝功能生化指標異常，或肝臟影像學檢查異常，通過常規的病史詢問、體格檢查和實驗室檢查仍不能明確病因，部分患者因不能及時明確病因而延誤治療，導致病情持續進展[1]。

不明原因肝損傷病因繁多，常見的有：非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、藥物性肝損傷(DILI)、自身免疫性肝病[包括自身免疫性肝炎(AIH)、原發性膽汁性膽管炎(PBC)、原發性硬化性膽管炎(PSC)]、遺傳性代謝性肝病(Caroli綜合征、Alagilli 綜合征、先天性膽道閉鎖等遺傳性發育異常，以及肝組織銅、鐵、卟啉、氨基酸、尿素、糖、果糖、乳糖、脂蛋白和脂質、膽紅素、膽汁酸等代謝異常引起的肝臟疾病)、膽汁淤積性肝病、血管性肝病(累及肝靜脈、門靜脈、肝動脈及其分支的疾病)以及感染性病因(如隱匿性肝炎病毒感染，非嗜肝病毒、細菌、真菌、寄生蟲等的感染)。此外其他系統疾病也可累及肝臟，如心血管疾病、內分泌疾病、血液系統疾病和結締組織病等[2-3]。

生物樣本庫建設是臨床醫學研究的基石，它作為基礎研究成果向臨床應用轉化的平臺，在疾病診斷、新藥研發、疾病相關基因檢測及流行病學研究中均有重要作用[4-5]。有效的生物樣本是開展基礎研究的前提，基于此，不明原因肝病生物樣本庫收集和存儲我院肝病科不明原因肝病住院患者的血漿、白膜層以及外周血單個核細胞(PBMC)樣本，并將樣本捐獻者的臨床信息和樣本的編碼信息錄入南京市多中心生物樣本庫系統，為不明原因肝病的進一步研究提供實驗樣本和詳細的臨床資料。

資料與方法

一、研究對象

收集2018年7月至2019年6月于南京中醫藥大學附屬南京醫院(南京市第二醫院)肝病科就診的肝功能異常住院患者，通過病史、各種常規化驗及輔助檢查不能明確病因，均行肝穿刺活檢，共191例，其中男性67例，女性124例。本生物樣本庫通過了南京中醫藥大學附屬南京醫院(南京市第二醫院)倫理委員會審查，所有研究對象均簽署了知情同意書。

二、主要儀器耗材

-196 ℃液氮罐(Thermo)、-80 ℃超低溫冰箱(DW-HL668)、冷鏈監控系統(Haier)、低溫生物標本轉移箱(BIO-CARRIER)、低溫離心機(Thermo Scientific SL 16R)、制冰機(GRANT)、電泳儀(DYY-2C)、凝膠成像系統(Tanon-1600)、超微量分光光度計(Thermo)、條碼打印機(L-MARK)、掃碼槍(Honeywell)、凍存管和凍存盒(萬格)。

三、樣本的采集、處理與保存

采集不明原因肝病住院患者全血樣本各兩管，每管5 mL，樣本采集后立即置于低溫生物標本轉移箱，低溫運輸至實驗室，由生物樣本庫專職人員離心分裝：①3 500 r/min離心10 min，分離血漿與白膜層，血漿分裝凍存管4～10管，200 μL/管。白膜層分裝凍存管1～2管，400 μL/管；②根據臨床工作的具體情況，按照標準步驟提取PBMC。所有樣本均在生物安全柜中分裝，并分別在凍存管上貼上條碼標簽。

四、樣本入庫與信息管理

樣本庫專職人員登錄南京市多中心生物樣本庫系統，對樣本實行條碼掃描存儲，錄入患者的一般信息(住院號、姓名、性別、年齡、民族、聯系方式、臨床診斷、病理診斷、治療方案、隨訪信息等)、樣本信息(樣本類型、樣本編號、入庫時間、位置登記號等)以及肝穿刺病理信息。

五、樣本質量控制

DNA和RNA通常作為生物樣本質量分析的標準，抗凝血中的白膜層是體細胞核酸的主要來源[6-7]。隨機抽取5例白膜層樣本，按照Qiagen QIAamp DNA Mini Kit說明書提取樣本DNA，按照Trizol抽提法提取樣本RNA。

結 果

一、樣本收集情況

自2018年7月至2019年6月，生物樣本庫共納入不明原因肝病患者191例，183例患者得到明確診斷，其中NAFLD 42例(21.98%)，PBC 20例(10.47%)，DILI 30例(15.71%)，AIH 29例(15.18%)，血管性肝病20例(10.47%)，酒精性肝病7例(3.66%)，重疊綜合征12例(6.28%)，膽汁淤積性肝病11例(5.76%)，遺傳性代謝性肝病5例(2.62%)，感染性病因3例(1.57%)，其他系統疾病4例(2.09%)，原因未明8例(4.19%)。不明原因肝病生物樣本庫共收集了2 007份樣本，其中血漿樣本1 625份，白膜層樣本333份，PBMC樣本49份。同一患者收取的樣本類型根據臨床工作的具體情況而定，并非所有樣本全部收取。

二、樣本質量控制

DNA質量鑒定：從現存的樣本中隨機抽取5例白膜層樣本。將抽提的DNA 經 1% 瓊脂糖凝膠電泳后可見條帶清晰(圖A)，無明顯 DNA 降解，證明所存儲標本的 DNA 質量良好。

RNA質量鑒定：從現存的樣本中隨機抽取5例白膜層樣本，將抽提的總 RNA 經 1% 瓊脂糖凝膠電泳后，基本上可見明顯的 28 s 和 18 s 條帶(圖B)，且28 s 條帶的亮度為 18 s 亮度的 1.5～2.0 倍。提示 RNA 保存效果良好。

圖 隨機抽取5例白膜層樣本的DNA和RNA電泳圖

討 論

隨著精準醫療的發展，在進行個性化治療和臨床研究時越來越離不開生物樣本的支持，生物樣本庫資源及其臨床數據庫受到廣泛重視[8-9]。人體生物樣本庫在國外已有多年歷史，已經建立了血清生物樣本庫以及組織庫[10-11]，國內樣本庫處于初級階段，目前黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院婦科生物樣本庫[5]、哈爾濱醫科大學附屬第二醫院結直腸腫瘤生物樣本庫[12]、湖北省中醫院超重/肥胖人群生物樣本庫[4]、中山大學附屬第五醫院生物樣本庫[7]等樣本庫已經初步建立，但是針對不明原因肝病人群的生物樣本庫建設較少見。

南京中醫藥大學附屬南京醫院作為江蘇省唯一的三級甲等傳染病醫院，肝病患者較多，這為我院的不明原因肝病生物樣本庫提供了寶貴的樣本資源。為了收集和整合肝病科室分散的臨床資源，由肝病專家楊永峰建立的不明原因肝病研究團隊牽頭，南京市重點實驗室經費支持，我院于 2016 年底開始籌建不明原因生物樣本庫。我院樣本庫收集的191例患者中NAFLD、DILI和AIH患者占了較大比例，這與國內張思敏等[13]研究結果相一致。

高質量生物樣本的使用，是轉化醫學進一步發展的關鍵因素，所以生物樣本的質量控制是樣本庫的關鍵[14-15]。根據我院實際情況，不明原因肝病生物樣本建立了規范化的樣本收集流程，同時定期對樣本進行質量檢測。本研究中隨機抽樣檢測的5例樣本核酸均無明顯降解，證明按照目前收集存儲管理流程收集的不明原因肝病生物樣本質量良好，能夠滿足后續實驗需求。

我院不明原因肝病生物樣本現為建設初期，在建設過程中也總結了一些經驗和遇到的問題：①在標本采集過程中，樣本離體時間和樣本入庫時間是影響樣本質量的關鍵因素。因此，我們有專職工作人員配合醫生護士，確保血漿和白膜層樣本離體后能在2 h內存入超低溫冰箱，避免樣本核酸降解和蛋白異常表達。樣本存儲后，確定樣本質量是否合格，為后續進行科學研究提供高質量標本。②臨床醫生重視度不夠，留取樣本積極性不高。因此，我們定期對臨床醫生開展樣本庫介紹，推廣樣本庫共享理念，鼓勵臨床醫生收集樣本，溝通科研設計思路。③加強樣本庫工作人員培訓力度，定期進行業務知識培訓，執行樣本庫標準化收集與管理流程。

我院初步建立了不明原因肝病生物樣本庫，制定了標準化的樣本庫運行和管理規章制度，每一份樣本都攜帶完整的臨床信息。同時，在不斷整合本院自身資源的同時，與國內多個分中心建立長期良好合作關系，深入開展不明原因肝病的基礎研究，為今后不明原因肝病的進一步研究提供高質量的樣本資源，對研究不明原因肝病具有十分重要的意義。