阿侖膦酸鈉對(duì)大鼠成骨細(xì)胞的影響

賴(lài)蔚文，戴 閩，戴 玥

(1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江西 南昌 330000；2.贛州市于都縣人民醫(yī)院，江西 贛州 342300)

成骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞，在骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化中起到重要的作用[1]。成骨細(xì)胞的功能很大程度上取決于成骨細(xì)胞的成熟度和成骨細(xì)胞的狀態(tài)[2]。所以成骨細(xì)胞功能多用于骨質(zhì)疏松的臨床評(píng)價(jià)中。阿倫磷酸鈉作為治療骨質(zhì)疏松的一線(xiàn)藥物，可以有效降低老年患者脊柱、髖部和非脊柱部位骨折的風(fēng)險(xiǎn)[3]。因此，本文主要探討阿倫磷酸鈉通過(guò)對(duì)成骨細(xì)胞的影響，從而為骨質(zhì)疏松治療方案提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料：本研究實(shí)驗(yàn)材料及試劑見(jiàn)表1所示。

1.2方法：以6個(gè)月齡的20只SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，隨機(jī)分為阿侖膦酸鈉組B(n=10)和空白對(duì)照組(n=10)。空白對(duì)照組大鼠每日灌胃生理鹽水，阿侖膦酸鈉組B大鼠每日灌胃阿侖膦酸鈉維D3的水溶液，劑量按照人鼠體表面積折算，劑量為 3.5 ml/(kg·d)。采用雙能X線(xiàn)吸收法(DXA)分別于治療前、治療后26周和治療后52周，測(cè)量大鼠腰椎L2～4、股骨頸、大轉(zhuǎn)子與全髖關(guān)節(jié)4個(gè)部位的骨密度值，并比較治療前后各部位骨密度的變化。選擇Ⅱ型膠原酶處理SD級(jí)大鼠(24 h以?xún)?nèi))，分離大鼠的顱骨，得到成骨細(xì)胞。在0.25%胰蛋白酶的消化傳代進(jìn)一步培養(yǎng)，得到二代細(xì)胞。隨后取第二代成骨細(xì)胞，接種，細(xì)胞80%融合后棄去培養(yǎng)基；①換加入不同濃度阿侖膦酸鈉(1.0×10-10～1.0×10-4)的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24 h、36 h、48 h，加入MTT溶液20 μl，于37℃ 5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄去上層溶液，加入DMSO試劑150 μl，輕輕振蕩混勻，10 min后，用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)下每孔的吸光度，確定不同濃度阿侖膦酸鈉對(duì)成骨細(xì)胞增值促進(jìn)、抑制作用；②換加含不同濃度阿侖膦酸鈉溶液(0mol/L、1.0×10-7mol/L～1.0×10-4mol/L)的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)48 h、72 h。棄培養(yǎng)基，以PBS清洗，加入0.1%Ttiton×100溶液250 μl。10 min后收集裂解液，取上清液，采用對(duì)硝基苯膦酸二鈉法測(cè)定細(xì)胞堿性膦酸酶活性。本次研究經(jīng)過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

表1 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)試劑

2 結(jié)果

2.1用MTT法測(cè)定阿侖膦酸鈉對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響:MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：在24 h、36 h、48 h時(shí)，與空白組相比較，濃度為1.0×10-5mol/L和1.0×10-4mol/L的阿侖膦酸鈉對(duì)成骨細(xì)胞的增殖有抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。1.0×10-7mol/L、1.0×10-6mol/L的阿侖膦酸鈉對(duì)成骨細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。1.0×10-8mol/L增殖作用最強(qiáng)有非常顯著性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)表2。

2.2成骨細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.0×10-5mol/L和1.0×10-6mol/L濃度的阿侖膦酸鈉藥物可使大鼠成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶活性提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)表3。

2.3骨密度值測(cè)定結(jié)果:與治療前對(duì)比，阿侖膦酸鈉組B治療26周時(shí)，骨密度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.143，P<0.05);治療52周時(shí)，骨密度升高顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.719，P<0.00)。與空白對(duì)照組比較，在治療26周時(shí)，兩組骨密度具有明顯差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.171，P<0.05);在治療52周時(shí)，兩組骨密度亦差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.946，P<0.05)。見(jiàn)表4。

表2 不同濃度的阿侖膦酸鈉溶液在作用24 h、36 h、48 h后對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響

表3 阿侖膦酸鈉作用48 h、72 h對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響(金氏單位/克蛋白，

表4 予以阿侖膦酸鈉治療前后腰椎L2-4、股骨頸、大轉(zhuǎn)子與全髖關(guān)節(jié)4個(gè)部位的骨密度值比較

3 討論

阿侖膦酸鈉( Alendronate，ALN)是第三代雙膦酸鹽類(lèi)藥物，能夠減少骨量丟失、增加骨密度從而達(dá)到預(yù)防骨質(zhì)疏松性骨折的作用，是目前臨床治療骨質(zhì)疏松癥的一線(xiàn)用藥[4]。過(guò)去臨床上對(duì)骨質(zhì)疏松癥的研究中，多采用抑制破骨細(xì)胞功能的方式來(lái)增加骨密度，但抑制破骨細(xì)胞功能可能產(chǎn)生不良后果，所以臨床研究中探究成骨細(xì)胞功能對(duì)預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松為主要方向[5]。阿侖膦酸鈉在一定濃度可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、增強(qiáng)ALP活性，是治療骨質(zhì)疏松的主要藥物[6]。本次研究中以不同濃度的阿倫磷酸鈉分析對(duì)成骨細(xì)胞的增殖分化及骨密度的影響，目的在于為臨床治療骨質(zhì)疏松提供有效參考依據(jù)。

本研究通過(guò)將Ⅱ型膠原酶處理大鼠(24 h以?xún)?nèi))，并分離大鼠的顱骨，得到成骨細(xì)胞。在0.25%胰蛋白酶的消化傳代進(jìn)一步培養(yǎng)，得到二代細(xì)胞。采用鈣鈷法對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶染色，了解阿侖膦酸鈉對(duì)于成骨細(xì)胞活性的影響，并探究不同濃度的阿侖膦酸鈉對(duì)于大鼠成骨細(xì)胞的增殖分化情況，阿侖磷酸鈉對(duì)SD大鼠骨密度值的影響。研究指出，阿侖膦酸鈉能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖分化。濃度為1.0×10-5mol/L和1.0×10-4mol/L的阿侖膦酸鈉能夠抑制成骨細(xì)胞的增殖作用；濃度為1.0×10-7mol/L、1.0×10-6mol/L的阿侖膦酸鈉對(duì)成骨細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用；濃度為1.0×10-8mol/L的阿侖膦酸鈉增殖作用最強(qiáng)有非常顯著性差異；阿侖膦酸鈉有利于提高大鼠的骨密度。

綜上所述，阿侖膦酸鈉能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖分化，提高大鼠的骨密度。