腫瘤微環境中分泌的糖蛋白相關的逆轉錄相關基因在肝細胞癌發展中的作用研究

唐玉蓮,李根亮,倪安妮

(右江民族醫學院，廣西 百色 533000)

腫瘤微環境(tumor microenvironment, TM)是腫瘤賴以生存的環境，與腫瘤的發生、發展及轉移有著密切的關系[1]。腫瘤微環境除了腫瘤基質細胞外，還包括細胞外基質、分泌蛋白、細胞因子和趨化因子等。細胞外基質(Extracellular matrix, ECM)是腫瘤微環境的重要組成部分，它主要是由成纖維細胞所分泌的蛋白質和多糖所構成的網絡結構，包括一些膠原、彈性蛋白、蛋白聚糖、糖蛋白等。正是由于這些成分賦予了細胞外基質一定的強度、韌性以及抗壓能力[2]，形成了細胞賴以生存的環境。腫瘤發生發展過程中，逆轉錄酶和生長因子等可異常激活，導致細胞發生惡性增殖現象以及形成異常微環境[3]。那么，腫瘤發生發展過程中，細胞外基質發生了何種變化，哪些逆轉錄相關基因參與構建了異常細胞外基質，細胞外基質中的重要組分-糖蛋白又是如何構建異常細胞外基質參與肝細胞癌發展的？這些問題目前尚有待進一步研究。

目前，雖然有報道在腫瘤發生過程中，腫瘤可驅動細胞外基質重塑，細胞外基質中的各種組分都在發生各種變化[4]。但是，結合逆轉錄相關基因，對細胞外基質進行綜合分析，特別是對糖蛋白相關的逆轉錄基因在肝細胞癌中可能作用的分析研究未見報道。

因此，本研究以逆轉錄相關基因(reverse transcription related genes, RTGs)為背景，通過建立小鼠肝癌模型，取成瘤小鼠瘤體組織作為TM，并以癌旁組織作為對照，通過RNA-seq及生物信息學手段，分析TM和對照組織間差異表達的糖蛋白相關RTGs以及它們在癌組織中的作用，探討其在構建異常細胞外基質參與肝癌發展的可能作用，并通過RT-qPCR驗證試驗結果，這將有助于進一步理解腫瘤發生、發展及遷移機制，為腫瘤的防治提供一定的思路。

1 材料與方法

1.1H22肝癌小鼠模型建立及樣本獲取：H22肝癌細胞系購自南京凱基生物技術有限公司。選取鼠齡7周左右，體重22～25 g的健康昆明小鼠100只，體外培養H22肝癌細胞至指數增長期，3 000 r/min離心取細胞，無菌生理鹽水洗滌，生理鹽水稀釋至濃度105個細胞/ml，給予每只小鼠雙前肢腋下接種細胞懸液0.2 ml，正常飼養4周后，取TM和癌旁組織。本次研究經過本院醫學倫理委員會同意。

1.2RNA的提取和測序：兩種樣本組織各取50 μg，使用商品化RNA提取試劑盒提取總RNA。RNA質量檢測、逆轉錄、文庫構建及測序數據的處理按常規程序進行。

1.3逆轉錄相關差異表達基因篩選:通過NCBI中的nucleotide數據庫檢索Reverse transcript，刪除重復項后的檢索結果作為比對背景，與測序數據中的差異表達基因比較，篩選出兩樣本中差異表達的RTGs。

1.4逆轉錄相關差異表達基因的功能富集分析:采用DAVID 6.8數據庫進行功能富集，分析其功能并篩選出糖蛋白相關的RTGs。

1.5RT-qPCR驗證逆轉錄相關差異表達基因的表達情況:隨機選取4個逆轉錄相關差異表達基因進行RT-qPCR，驗證其表達量以及RNA-seq測序結果。引物使用Primer-Blast軟件進行設計，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.6糖蛋白相關RTGs的編碼蛋白的互作網絡分析:采用STRING 11.0 數據庫對糖蛋白相關RTGs的編碼蛋白進行蛋白網絡互作分析，分析其分布和功能相關性。

1.7糖蛋白相關RTGs的AS和SNV/INDEL與基因表達的相關性分析:利用Excel軟件對糖蛋白相關RTGs中出現的AS和SNV/INDEL進行χ2檢驗，以P<0.05且兩樣本間發生頻率數≥2的差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1RNA-seq測序分析:提取實驗組和對照組樣本總RNA送公司測序，分別獲得了5.01G base(35.28M clean reads)和5.02G base (35.32M clean reads)的數據。兩樣本所得clean reads數據與基因組的匹配率分別為93.65%和89.20%，且兩樣本測序數據的Q20皆大于99%，測序數據質量較高。

2.2逆轉錄相關差異表達基因篩選和功能富集分析:NCBI檢索逆轉錄相關基因，共檢索到28157條逆轉錄相關基因條目，經DAVID 6.8數據庫注釋，共在小鼠物種中獲得99個RTGs。通過與測序數據比對，共獲得了24個差異表達RTGs。其中，上調表達12個，下調表達12個。在TM中，上調表達的12個基因分別為Sh3d21、Cdyl、Tmod3、Loxl2、Col11a1、Traf1、Ehd1、Lox、Fmnl3、G3bp1、Nfkbia、Actn1；下調表達的12個基因分別為Fam155a、Cped1、Abcd2、Prkce、Tmco4、Igsf23、Hand2、Naxd、Il1rn、Slc23a1、Tnfrsf1b、Fas。經功能富集分析，共得到1個BP、1個CC、4個MF和4個UP_SEQ_FEATURE。見圖1。

注: BP: 生物學程序; CC: 細胞組分; MF: 分子功能; UP_SEQ_FEATURE: 蛋白位點序列特征圖1 差異表達的逆轉錄相關基因(RTGs)的功能

進一步功能分析，發現Col11a1、Il1rn、Lox、Loxl2、Slc23a1、Abcd2、Fam155a等參與了異常細胞外基質中糖蛋白構建，其中Col11a1、Lox、Loxl2等廣泛參與了膠原纖維形成、糖蛋白亞基間二硫鍵連接、金屬離子結合以及細胞外信號轉導等。這些基因與Naxd還一同參與了蛋白質糖基化，特別是N-連接糖基化。

2.3逆轉錄相關差異表達基因的RT-qPCR驗證:隨機選取4個逆轉錄相關差異表達基因進行RT-qPCR分析，內參基因為GAPDH，引物序列見表1。數據結果表明，其結果與RNA-seq結果一致。見圖2。

2.4糖蛋白相關RTGs的編碼蛋白的互作網絡分析：對糖蛋白相關RTGs編碼蛋白的互作網絡關系分析，發現Col11a1、Lox、Loxl2、Il1rn、Prkce、Naxd、Ehd1等編碼蛋白的相關性較強。見圖3。

表1 RT-qPCR 引物

注: 圖中數值為癌旁組織/TM取以5為底的對數值圖2 用 RT-qPCR與RNA-seq分析TM和癌旁組織中逆轉錄相關差異表達基因的表達情況

圖3 TM中糖蛋白相關RTGs編碼蛋白的互作網絡關系

2.5糖蛋白相關RTGs的AS和SNV/INDEL與基因表達的相關性分析：對糖蛋白相關的RTGs的可變剪切事件(AS)、單核苷酸變異(SNV)/插入缺失標記(INDEL)分析，結果顯示：均未發現AS，但9個基因發生了82個SNV和4個INDEL位點的改變。9個基因的AS和SNV/INDEL與基因表達的相關性中5個基因的SNV和1個基因的INDEL在兩樣本中存在統計學差異，且其發生頻率與基因表達呈正相關。見表2 。糖蛋白相關的幾個主要基因Col11a1、Lox、Loxl2、Prkce、Ehd1均存在SNV和INDEL位點改變。見表3。其中Col11a1發生了1個INDEL和31個SNV；Lox發生了1個INDEL和1個SNV；Loxl2和Prkce均發生了8個SNV；Ehd1發生了2個SNV，這些基因位點的改變主要發生在基因的3個部位，即外顯子區(exonic)、內含子區(intronic)和基因間區(intergenic)。

3 討論

實體腫瘤的發生發展常伴隨著細胞外基質的過量沉積及其組織形式的異常[5]。細胞外基質蛋白的結構與功能受糖基化、共價交聯等翻譯后修飾的調控，且細胞外基質網絡結構與功能的紊亂將導致癌癥、組織纖維化、結締組織異常等多種疾病的發生[6]。通過研究，發現在TM中異常表達多個逆轉錄相關基因，它們的分子生物學過程主要集中在腫瘤異常微環境細胞外基質的構建方面(如膠原纖維組織、糖蛋白、細胞外基質等)。尤其值得一提的是，存在大量糖蛋白參與這一生物學過程。糖蛋白是細胞外基質的重要組成成分，包括不溶性大分子的結構糖蛋白和各種非結構性糖蛋白。腫瘤細胞外基質與正常組織實質相比，含有更多的膠原蛋白[7]，而糖蛋白的異常糖基化則與肝癌密切相關[8]。由此可見，糖蛋白參與了腫瘤的發生、發展過程。

表2 SNV/INDEL發生頻率與基因表達的相關性

表3 TM中主要幾個糖蛋白相關RTGs的SNV/INDEL發生情況

筆者在TM中發現大量糖蛋白相關的RTGs差異表達，這說明糖蛋白對腫瘤的發生、發展可能有很大影響。蛋白位點序列特征分析表明，有8個差異表達的糖蛋白相關RTGs，即Col11a1、Il1rn、Lox、Loxl2、Slc23a1、Abcd2、Fam155a和naxd，它們都含有糖蛋白N-連接型糖鏈(簡稱N-糖鏈)的糖基化位點，其中兩個還具有類賴氨酰氧化酶感興趣區域、賴氨酸酪氨酸醌交聯區及銅離子結合位點等活性連接區。結合此前的一些報道，糖基化位點與糖基化水平異常與腫瘤的發生、發展密切相關[9-10]。這說明，TM中異常表達的糖蛋白可能主要通過N-粘連、N-乙酰葡糖胺的糖基化、賴氨酸酪氨酸醌的交叉粘連、金屬離子結合以及類賴氨酰氧化酶結合等形式構建異常的胞外基質。另差異表達基因的4個MF則表明，差異表達的糖蛋白還可能通過蛋白質賴氨酸6-氧化酶活性、氧化還原酶活性、作用于供體的CH-NH2、氧作為受體、ATP結合、甲基化組蛋白結合等參與肝細胞癌的發生、發展。賴氨酸6-氧化酶起胺氧化酶的作用，在細胞外基質的調制過程中修飾賴氨酸殘基促進膠原和蛋白交聯[11]；氧化還原酶通過調節氧化還原穩態和細胞外基質微小而漸進的變化具有促進纖維化作用等[12]。

筆者的研究表明，在肝癌組織中Col11a1、Lox、Loxl2等上調表達，Slc23a1、Abcd2、Fam155a、Prkce、Il1rn以及naxd等下調表達。其中，上調表達的Col11a1，能夠通過控制Ⅱ型膠原纖維的橫向生長而在纖維發生中起重要作用，并通過編碼Ⅱ型膠原蛋白參與腫瘤的發生、發展。此外，Col11a1還可活化間質干細胞成為癌相關成纖維細胞，從而導致腫瘤生長和預后不良[13]。上調表達的細胞外銅依賴性胺氧化酶Lox (賴氨酰氧化酶)及Loxl2(賴氨酰氧化酶樣蛋白2)，在細胞外基質中不僅可以將賴氨酸殘基氧化脫氨基從而介導纖維膠原和彈性蛋白交聯，維持細胞外基質結構[14-15]，還可作為血管生成的調節因子，介導Ⅳ型膠原支架形成，從而發揮調節血管生成、營養腫瘤細胞的作用。

另外，筆者通過AS和SNV/INDEL分析，發現這些糖蛋白相關RTGs在腫瘤組織中異常表達與它們的基因多態性相關，有9個基因發生了82個SNV和4個INDEL位點的改變，且具有統計學意義的SNV和INDEL的發生頻率與相應基因的表達呈正相關。這些基因位點的改變主要發生在參與轉錄調控的重要區域，如外顯子區、內含子區或基因間區。這表明，SNV和INDEL引進的基因多態性在肝癌中扮演著調控基因表達的重要角色。

綜上所述，本研究通過RNA-seq及生物信息學手段闡釋了腫瘤發生、發展過程中細胞外基質的改變，并進一步闡述了細胞外基質中的重要組分-糖蛋白相關差異表達基因在構建異常細胞外基質參與肝癌發生、發展中的作用，對進一步理解腫瘤發生、發展及遷移機制具有重要的意義。

致謝

本研究由廣西自然科學基金(2016GXNSFAA380177和2015GXNSFAA139219)、廣西研究生教育創新計劃項目(NO:JGY2020164)共同資助。