田薊苷固體分散體的制備及體內藥動學研究

于 寧 譚梅娥 鄭瑞芳 曾曉紅

1.新疆維吾爾自治區藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830002；2.烏魯木齊市第一人民醫院，新疆 烏魯木齊 830004

田薊苷(Tilianin，Til)是從新疆維吾爾族習用藥材香青蘭中，提取分離得到的天然黃酮類活性單體。香青蘭主要用于治療冠心病和高血壓，始載于維吾爾古典醫籍《阿里卡農》，已經有數百年的藥用歷史。課題組前期研究證明，Til是香青蘭抗心肌缺血再灌注損傷的主要活性物質，與普萘洛爾療效相比，較小劑量的Til即具有同等作用[1-5]。但Til水溶性差，在37 ℃純水中的平衡溶解度為1.57 mg/L，導致其體內吸收受到極大限制，嚴重影響藥效發揮[6-8]。

固體分散體(Solid Dispersion，SD)是將難溶性藥物在一定條件下高度分散到水溶性高分子材料中形成的一種給藥制劑，其制備工藝相對簡單，能夠將藥物高度分散，可大大改善藥物的溶出與吸收，從而提高藥物生物利用度，近年來，它已成為改善中藥難溶性藥物溶解性的常用技術[9-16]。因此，本實驗將Til制成固體分散體(Til-SD)，測定累積溶出度，采用DSC技術研究晶型變化，考察體內藥動學，以期為Til相關口服制劑研究提供參考。

1 儀器與材料

Agilent1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；DRT TW型調溫電熱套(鞏義市予華儀器有限責任公司)；AB135-S梅特勒-托利多電子天平(瑞士)；ZRS-8GD智能溶出儀(天津市天大天發科技有限公司)；101-1型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海躍進醫療器械廠)；DZF-150型數顯恒溫真空干燥箱(河南省大康縣教材儀器廠)；EYELASB-2000型旋轉蒸發儀(上海愛朗儀器有限公司)；Vortex-5渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；KQ-100 DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；200F-3型差示掃描量熱儀(德國耐士科技有限公司)。

田薊苷原料藥(批號：20171012，純度≥98%，新疆維吾爾自治區藥物研究所)；PVPK30(批號：93811436W0，德固賽中國投資有限公司)；Eudragit EPO100(批號：B060362009, 德固賽中國投資有限公司)；Plasdone S-630(批號：15100265044，德國BASF公司)；乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；其他試劑均為分析純；清潔級SD大鼠，體質量230～270 g，購自新疆醫科大學動物中心，許可證號：SCXK(新)2011-0004。

2 方法與結果

2.1 Til含量測定

2.1.1 色譜條件 Hypersil BDS C18 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.5%甲酸水溶液(27∶73)；體積流量1.0 mL/min；波長為330 nm；柱溫為35 ℃。

2.1.2 線性關系考察 精密稱取Til對照品適量，加入適量乙腈超聲溶解，配制成每1 mL含Til 1 80 μg 的對照品儲備液，采用乙腈逐步稀釋成1.80、3.24、9.00、12.60、18.00、27.00 μg/mL的系列Til對照品溶液，在“2.1.1”項下色譜條件下進樣測定，以峰面積(Y)對溶液質量濃度(X)進行回歸，得方程為Y=29.311X+2.3420，r= 0.9993，表明在1.80～27.00 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.3 方法學考察 取濃度為18.00 μg/mL的Til對照品溶液，在上述色譜條件下，連續進樣6次，測得峰面積的RSD為1.22%，表明儀器精密度良好；取Til-SD適量置于50 mL量瓶中，45 mL乙腈超聲處理后定容至50 mL，于0、2、4、6、8、12 h在上述色譜條件下進樣測定，測得峰面積RSD為1.37%，表明供試品溶液室溫放置12 h內穩定；精密稱取已知含有量的Til-SD適量，加入一定質量濃度的對照品溶液，置于50 mL量瓶中，45 mL乙腈超聲處理后定容至 50 mL，在上述色譜條件下進樣測定，測得加樣回收率為98.89～101.01%，RSD為1.13%。

2.2 體外溶出度試驗 取待測樣品適量，相當于原料藥20 mg，加入適量蒸餾水制成混懸液后置于活化后的透析袋中。用含0.2% SDS水溶液900 mL作為溶出介質，溫度為37 ℃，轉速為100 r/min，分別于10、15、30、45、60、90 min時取樣2 mL，補加同體積等溫空白溶出介質，取樣溶液用 0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液在“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，計算不同時間點的累積溶出度。

2.3 Til-SD制備工藝研究

2.3.1 制備方法載體材料及的比較 篩選親水性高分子載體材料PVPK30、Eudragit EPO100、Plasdone S-630，分別通過溶劑法、溶劑-熔融法和熔融法制備固體分散體，確定Til-SD的制備方法及載體材料。

2.3.1.1 溶劑法 稱取Til 20 mg、載體材料PVPK30、Eudragit EPO100、Plasdone S-630分別稱取140 mg(原料與載體比例為1∶7)，置于圓底燒瓶中，加入100 mL無水乙醇，攪拌直至Til和載體均溶解成澄明液體，減壓旋蒸除去有機溶劑，迅速置于-20 ℃冰箱中冷凍固化24 h后，將干燥物取出，研碎，過80目篩，置干燥器避光保存。

2.3.1.2 溶劑-熔融法 稱取Til 20 mg置于燒杯中，加入100 mL無水乙醇，備用；載體材料PVPK30、Eudragit EPO100、Plasdone S-630分別稱取140 mg，置于圓底燒瓶中，在80 ℃水浴加熱使其熔融，將Til無水乙醇溶液加入熔融載體中繼續攪拌均勻后，繼續攪拌至60 min，水浴蒸發除去有機溶劑，迅速置于-20 ℃冰箱中冷凍固化24 h后，其他操作同上溶劑法。

2.3.1.3 熔融法 載體材料PVPK30、Eudragit EPO100、Plasdone S-630分別稱取140 mg，置于燒杯中，在80 ℃水浴加熱其熔融，加入Til 20 mg，邊加邊攪拌，使Til完全融于載體中，迅速置于 -20 ℃ 冰箱中冷凍固化24 h后，其他操作同上溶劑法。

測定上述方法制備的Til-SD累積溶出度，結果如圖1～3所示。表明，采用溶劑-熔融法、載體為Plasdone S-630制備Til-SD，Til的累計溶出度在60 min時，可達到90%以上，因此，確定采用溶劑-熔融法，載體為Plasdone S-630制備Til-SD。

圖1 溶劑法制備不同載體的Til-SD體外溶出曲線

圖2 溶劑-熔融法制備不同載體的Til-SD體外溶出曲線

圖3 熔融法制備不同載體的Til-SD體外溶出曲線

2.3.2 原料與載體材料比例的篩選 以Plasdone S-630為載體材料，Til原料用量為20 mg、分別選擇原料與載體比例為1∶3、1∶5、1∶7、1∶9，照上述溶劑-熔融法制備固體分散體。測定并計算Til累積溶出度，結果如圖4所示，表明，原料與載體比例為1∶7和1∶9時，Til的累積溶出度接近且均高于1∶3和1∶5，因此，選擇原料與載體比例為1∶5、1∶7、1∶9進行正交試驗。

2.3.3 制備溫度的確定 以 Plasdone S-630為載體，稱取原料用量20 mg、原料與載體比例為1∶7、制備溫度分別為 60、70、80、90 ℃，照上述溶劑-熔融法制備Til-SD，測定并計算其Til累積溶出度。結果如圖5所示。可知，隨著制備溫度的增加，Til累積溶出度逐漸增加且均高于原料藥，且制備溫度分別為70、80、90 ℃時，Til累積溶出度明顯高于60 ℃時制備的Til-SD，故選擇制備溫度為70、80、90 ℃進行正交試驗。

2.3.4 攪拌時間的篩選 以Plasdone S-630為載體材料，稱取原料用量20 mg，原料與載體比例為1∶7，攪拌時間分別45、60、75、90 min，照上述溶劑-熔融法制備Til-SD。測定并計算累積溶出度，結果如圖6所示。可知，攪拌時間為 60、75、90 min時，Til累積溶出度明顯高于45 min，且均高于原料藥，但攪拌時間為90 min時，Til累積溶出度低于60、75 min，故選擇攪拌時間60、75、90 min 進行正交試驗。

圖4 不同載體比例的Til-SD體外溶出曲線

圖5 不同攪拌溫度的Til-SD體外溶出曲線

圖6 不同攪拌時間的Til-SD體外溶出曲線

2.3.5 正交試驗優化制備工藝 結合前期Til-SD單因素試驗考察情況，采用L9(34)正交實驗進一步優化Til-SD制備工藝。稱取Til原料20 mg，Plasdone S-630為載體材料適量，采用溶劑-熔融法，以Til累積溶出度為考察指標，選擇原料與載體材料比例(A)，制備溫度(B) ，攪拌時間(C) 3個主要因素，每個因素設置3個考察水平，因素水平、試驗設計與結果和方差分析分別見表1～3。

表1 因素與水平

表2 試驗設計與結果

表3 方差分析

直觀分析知，影響累積溶出效果的因素為：A(原料與載體材料比例)>B(制備溫度)>C(攪拌時間)。經方差分析可知：原料與載體材料比例和制備溫度對累積溶出度有顯著影響，鑒于攪拌時間對累積溶出度無顯著性影響。因此，為降低成本、節省工時，最終組合為A2B2C1即原料與載體材料比例為1∶7，制備溫度為80 ℃，攪拌時間為60 min。按照優化后的處方工藝制備3批Til-SD，結果顯示，在溶出30 min時，累積溶出度均達到90%。

2.4 體外溶出度測定 按“2.2”項下方法測定Til、Til-SD體外溶出度，結果如圖7所示。由此可知，在溶出30 min時，Til-SD累積溶出度為91.1%，而田薊苷僅為 12.3%。

2.5 Til-SD的差示掃描量熱法分析 取Til原料藥、Plasdone S-630、物理混合物以及Til-SD進行DSC分析。精密稱取約10 mg待測樣品置于DSC坩堝中，空白坩堝作對照，N2為保護氣，升溫范圍為20～300 ℃，升溫速率為10 ℃/min。結果如圖8所示。載體Plasdone S-630有一處吸熱峰，在69 ℃附近，為其熔點。原料藥Til在250 ℃附近有一處吸熱峰。物理混合物可看到田薊苷和Plasdone S-630的吸熱峰都存在。Til-SD中無Til的吸熱峰，只剩下Plasdone S-630的吸熱峰。說明此Til-SD中Til以非晶型均勻分散在載體Plasdone S-630中。

圖7 樣品體外溶出曲線

圖8 樣品DSC圖

2.6 大鼠體內藥動學研究

2.6.1 灌胃液配置 取Til原料藥、Til-SD適量，置于含0.5%羧甲基纖維素鈉的蒸餾水中，振搖使分散，配制成2 mg/mL(以Til計)混懸液，即得。

2.6.2 給藥方案與血樣采集 取大鼠12只，隨機分為2組，每組6只，實驗前12 h禁食不禁水，按50 mg/kg劑量(以Til計)分別給予上述2種灌胃液，于0.083、0.167、0. 25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、10、12 h玻璃毛細管眼眶取血約0.3 mL，置于含有10 μL肝素鈉的1.5 mL的EP管中，混勻后迅速離心5 min (4000 r/min)，轉移上層血漿至另一空白離心管中，冷凍保存。

2.6.3 血漿樣品處理方法 取血漿樣品在室溫下解凍，精密吸取100 μL置1.5 mL離心管中，加入乙腈100 μL，渦旋混合5 min，高速離心10 min (10000 r/min)，取上清液置離心管中，氮氣吹干，殘渣加入100 μL流動相復溶。

2.6.4 對照品溶液的配制 取“2.1.2”項下對照品儲備液，進一步用乙腈稀釋配制成540、252、180、64.8、36 ng/mL的系列對照品溶液。

2.6.5 線性及專屬性考察 精密量取100 μL的Til質量濃度為540、252、180、64.8、36 ng/mL的系列對照品溶液，氮氣吹去有機溶劑，加入 100 μL 大鼠空白血漿，按照“2.6.3”項下方法操作，記錄HPLC色譜峰面積，以Til質量濃度為橫坐標(X)，Til峰面積為縱坐標(Y)， 繪制標準曲線，回歸方程為Y=1.0243X+0.6763，r=0.9900，在36～540 ng/mL呈現良好的線性關系。專屬性試驗結果如圖9所示，表明該方法專屬性較高，樣品處理過程中未引入干擾性雜質，內源性物質不干擾Til的測定。

圖9 田薊苷HPLC色譜圖

2.6.6 方法學考察 取低、中、高質量濃度(36、180、540 ng/mL)的含藥血漿，日內精密度結果表明，低、中、高質量濃度血漿樣品的RSD分別為6.89%、6.78%和7.21% (n=3)；日間精密度RSD分別為8.56%、9.21%和7.34% (n=3)，表明該方法精密度良好。將測定質量濃度與實際配制質量濃度比較，計算回收率，在86.83%～94.01%之間。血漿樣品保存于-20 ℃冰箱中，于 0、1、2、3、4、5 d測定Til峰面積，得RSD為7.11%，表明樣品在放置過程中穩定性良好。

2.6.7 數據處理 按“2.6.2”項下給藥方法，按照“2.6.3”處理，“2.1.1”項色譜條件進行含量檢測，通過3P97程序統計矩模型計算主要藥動學參數，結果見表4，再繪制血藥濃度-時間曲線，結果如圖10所示。由此可知，Til-SD的Tmax顯著縮短 (P<0.05) ，Cmax、AUC0-t、AUC0-∞顯著升高 (P<0.05)，相對生物利用度增加到218.5%。

表4 Til和Til-SD經ig給藥后在大鼠體內的主要藥動學參數 (n=6)

圖10 樣品血藥濃度-時間曲線(n=6)

3 討論

固體分散體技術能改善難溶性藥物水溶性、溶出度。Til難溶于水，生物利用度較低，而將其制備成固體分散體可在一定程度上改善這些問題。本實驗首次將Til制備成Til-SD，以Til體外累積溶出度為考察指標，采用單因素試驗對制備方法、載體的種類、載體與原料比例、制備溫度、制備時間進行考察，在單因素試驗基礎上，采用正交試驗設計優化制備工藝，研究結果表明，當采用溶劑-熔融法，載體為Plasdone S-630，田薊苷與Plasdone S-630比例為1∶7，制備溫度為80 ℃，攪拌時間為60 min時，制備的Til-SD，在溶出 30 min 時，Til累積溶出度可達到90%，約為原料藥的7.4倍，解決了Til水溶性低的問題。在一定范圍內，Til-SD累積溶出度隨載體比例的增大而升高，可能是因為Til在載體Plasdone S-630中為非晶型分散狀態，分散度得到提高，故在很大程度上提高了累積溶出度；隨著制備溫度的升高，Til-SD的累積溶出度隨之增大，溫度過低不利于Til-SD的制備；隨著攪拌時間的延長，Til均勻分散在載體中累積溶出度增加，但是攪拌一定時間后趨于過飽和狀態，Til累積釋放百分率降低。

大鼠灌胃給藥Til原料藥及Til-SD，藥動學結果表明，與原料藥日服同劑量給藥相比較，Til-SD的T max、C max、AUC 0-t均有一定的差異，T max減小，說明Til-SD加快Til的吸收。C max增加，與體外溶出行為相吻合，說明體內外相關性較好。Til-SD的AUC 0-t是原料Til的約2.185倍，說明Til研制成Til-SD后，相對生物利用度提高到218.5%，進而表明增加了Til的吸收。Til原料藥與Til-SD體外溶出結果與體內藥動學結果呈現了體內外一致性。

目前多數研究仍以單一方法為主，缺乏對不同制備工藝制備固體分散體的比較。本實驗采用3種常用方法(溶劑法、溶劑-熔融法和熔融法)分別制備Til-SD，比較研究利用不同工藝制備Til-SD的累積溶出度差異。本實驗成功制備了Til-SD，其工藝簡單，材料安全，促進藥物吸收結果明顯，今后將對其藥效學進行評價，以期為相關制劑研發提供更全面可靠的依據, 為天然產物Til的研究、開發及應用提供更多的參考。