五味子乙素對帕金森病小鼠中腦黑質氧化應激及神經營養因子的影響

賈 璐 ， 樊慧杰 ， 王 青 ， 李彥青 ， 郭敏芳 ， 肖保國 ， 柴 智 ， 馬存根，

(1. 山西中醫藥大學多發性硬化益氣活血重點研究室 神經生物學研究中心 ， 山西 晉中 030619 ； 2. 山西大同大學腦科學研究所 ， 山西 大同 037009 ； 3. 復旦大學華山醫院神經病學研究所 ，上海 靜安 200025)

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一種好發于中老年人群的神經退行性疾病，由于中腦黑質多巴胺(Dopamine,DA)能神經元丟失，患者出現靜止性震顫、運動遲緩、肌肉僵直、步態異常等臨床癥狀。有學者預計，PD的全球流行率將在2040年翻倍，成為增長速度最快的神經退行性疾病[1]。目前，PD的發病機制尚未完全解析，但越來越多的研究表明，氧化應激是驅動DA能神經元丟失的關鍵因素。當機體氧化與抗氧化功能失調時，大量蓄積的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)會對腦細胞造成氧化損傷，致使DA能神經元壞死[2]。神經營養因子是神經細胞的有效調節因子，在神經系統發育過程中可促進神經元的生存與再生，與DA合成和維持DA能神經元的功能密切相關[3]。因此，氧化應激、神經營養因子可能是PD病理干預的重要靶點。

近年來，一些中藥及其有效成分對PD的防治作用日益明朗[4-5]。五味子乙素(Schisandrin B,Sch B)是從中藥五味子中分離提取的一種活性物質，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等藥理活性。多項研究表明，Sch B對神經元具有保護作用[6-7]，但目前尚無圍繞Sch B對PD小鼠腦組織氧化應激水平和神經營養因子表達影響的報道。基于此，本試驗采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)誘導的PD小鼠作為模型動物，通過檢測Sch B對PD小鼠腦部超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)和過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性、還原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量，以及腦源性神經營養因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和大腦多巴胺神經營養因子(Cerebral dopaminergic neurotrophic factor,CDNF)水平的影響，探究Sch B作為PD治療藥物的潛能。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Sch B，購自成都曼斯特生物科技有限公司；MPTP，購自美國Sigma公司；酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)、Alexa Fluor 594標記山羊抗兔IgG二抗抗體，均購自英國Abcam公司；SOD、CAT、MDA及GSH試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；BDNF ELISA試劑盒(檢測范圍：25～800 pg/mL，批內變異系數與批間變異系數分別小于10%和15%)和CDNF ELISA試劑盒(檢測范圍：31.25～1 000 pg/mL，批內變異系數與批間變異系數分別小于10%和15%)，均購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.2 主要儀器 冰凍切片機(CM 1950)、倒置熒光顯微鏡(DM40008/DFC450C)，德國LEICA公司；全波長酶標儀(Spectramax 384 plus)，美國Molecular Devices公司。

1.3 實驗動物 30只8～10周齡雄性C57BL/6小鼠(體重20～25 g)，購自北京維通利華實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(京)2016—0006。實驗動物在室溫(23±1) ℃，相對濕度40%～60%標準動物飼養室內適應性飼喂1周。

1.4 試驗方法

1.4.1 分組與造模 將小鼠隨機分成正常組、模型組和Sch B組，每組10只。滅菌生理鹽水溶解MPTP后腹腔注射制備PD小鼠模型，第1天注射劑量為15 mg/(kg·bw)，第2天為20 mg/(kg·bw)，第3～7天均為30 mg/(kg·bw)，每次注射間隔24 h。

1.4.2 藥物治療 從造模第1天起，Sch B組按照每天80 mg/(kg·bw)劑量灌胃，模型組和正常組小鼠予以等體積0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃，灌胃持續10 d。

1.4.3 曠場分析 末次灌胃24 h后采用曠場分析系統(Smart 3.0軟件)檢測小鼠自主行為。同時將4只小鼠分別放入4個敞箱底面中央，記錄連續5 min內小鼠的活動情況，獲得小鼠活動總距離、平均速度、休息時間和運動軌跡。每只小鼠測試3次取平均值，每次間隔10 min以上。試驗在安靜環境下進行，每次測試完畢用酒精清除氣味，避免干擾。

1.4.4 樣本制備 用10%水合氯醛(0.2 mL/只)腹腔注射麻醉小鼠后，推注生理鹽水(20 mL/只)進行心臟灌注。每組取5只小鼠進行4%多聚甲醛(20 mL/只)固定，分離腦組織經脫水、OCT包埋后進行低溫切片(厚度為10 μm)，用于免疫熒光染色。各組其余5只小鼠冰上取中腦黑質，用于氧化應激指標及神經營養因子檢測。

1.4.5 免疫熒光染色檢測黑質TH 將腦切片于PBS中浸泡15 min，TH抗體經PBS稀釋(1∶600)后4 ℃孵育過夜，次日PBS洗滌(5 min/次×3次)，加入二抗室溫孵育2 h，PBS洗滌(5 min/次×3次)。50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察、拍照(100倍)。采用Image J軟件分析熒光強度。

1.4.6 SOD、CAT、GSH、MDA檢測 中腦黑質稱重，按照質量∶體積=1∶9加入生理鹽水，用組織勻漿器在冰上充分研磨制備10%腦組織勻漿液，5 000 r/min離心10 min后取上清，按照試劑盒說明書測定各組小鼠SOD、CAT活性及GSH、MDA含量。

1.4.7 ELISA檢測BDNF、CDNF含量 用樣品稀釋液稀釋1.4.6中獲得的腦組織勻漿上清，取50 μL加入酶標包被板中，并加入酶標試劑100 μL，37 ℃溫育60 min，洗滌后加入顯色試劑避光顯色15 min，隨后加入終止液終止反應，450 nm波長測量各孔吸光度(OD值)。

1.5 統計分析 采用GraphPad Prism 5. 0軟件進行數據分析，計量資料以平均值±標準誤表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較使用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Sch B對PD小鼠行為學影響 曠場試驗結果如圖1所示，與正常組相比，模型組小鼠活動總距離和平均速度顯著減少(P<0.01)，休息時間明顯增加(P<0.05)，活動路線簡單，且在敞箱中央區域活動減少。與模型組比較，Sch B干預后小鼠活動總距離和平均速度顯著增加(P<0.01)，休息時間明顯縮短(P<0.05)，活動路線復雜多變，進入敞箱中央區域活動增加。

圖1 各組小鼠活動距離、平均速度、休息時間和自主活動路線比較Fig.1 Comparison of the total distance,mean speed,resting time and route of autonomous movement of mice in each groupA：各組小鼠活動總距離; B：各組小鼠平均速度; C：各組小鼠休息時間; D：各組小鼠自主活動路線與模型組相比，*：P<0.05，**：P<0.01; 下同A:Total distance of mice in each group; B:Mean speed of mice in each group; C:Resting time of mice in each group; D:Route of autonomous movement of mice in each groupCompared with the model group,*：P<0.05,**：P<0.01. The same as below

2.2 Sch B對PD小鼠黑質TH陽性神經元影響 免疫熒光染色結果如圖2所示，與正常組相比，模型組小鼠中腦黑質區TH熒光強度明顯減弱(P<0.01)。與模型組相比，Sch B組TH熒光強度顯著增強(P<0.01)。

圖2 各組小鼠黑質TH熒光強度比較Fig.2 Comparison of fluorescence intensity of TH in substantia nigra of mice in each groupA：正常組; B：模型組; C：五味子乙素組; D：各組小鼠TH熒光強度比較A:Normal group; B:Model group; C:Sch B group; D:Fluorescence intensity of TH of mice in each group

2.3 Sch B對PD小鼠黑質SOD、CAT活性及GSH、MDA水平影響 結果如圖3所示，與正常組相比，模型組小鼠SOD、CAT活性及GSH含量下降(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，MDA含量升高(P<0.01)；與模型組相比，Sch B組小鼠SOD、CAT活性及GSH水平上升(P<0.05，P<0.05，P<0.01)，MDA含量下降(P<0.01)。

圖3 各組小鼠黑質SOD、CAT活性和GSH、MDA含量比較Fig.3 Comparison of activity of SOD,CAT and content of GSH,MDA in substantia nigra of mice in each groupA：各組小鼠SOD活性； B：各組小鼠CAT活性; C：各組小鼠GSH含量； D：各組小鼠MDA含量A:SOD activity of mice in each group; B:CAT activity of mice in each group;C:GSH content of mice in each group; D:MDA content of mice in each group

2.4 Sch B對PD小鼠黑質BDNF和CDNF水平影響 ELISA結果如圖4所示，與正常組相比，模型組小鼠腦組織中BDNF和CNDF的表達均顯著降低(P<0.01，P<0.05)；與模型組相比，Sch B組小鼠BDNF和CNDF水平顯著升高(P<0.01)。

圖4 各組小鼠黑質中BDNF和CDNF水平比較Fig.4 Comparison of content of BDNF and CDNF in substantia nigra of mice in each groupA：各組小鼠BDNF含量； B：各組小鼠CDNF含量A:BDNF content of mice in each group; B:CDNF content of mice in each group

3 討論

PD是一種全球發病率僅次于阿爾茲海默病的中樞神經退行性疾病，臨床上主要表現為運動功能障礙。Sch B是從中藥五味子中提取出的一種有效成分，屬于聯苯環辛二烯衍生物，可通過多種生物學活性發揮神經保護作用。例如，Sch B可通過抗氧化作用緩解阿爾茲海默病模型小鼠的認知功能障礙[6,8]；在6-OHDA誘導的PD小鼠體內，Sch B能夠通過下調miR-34a保護黑質DA能神經元[9]。本試驗利用MPTP建立了PD小鼠模型，并通過行為學觀察和TH免疫熒光染色對模型進行了評估。TH作為一種DA合成限速酶，其含量會隨著PD小鼠DA能神經元退行性丟失而減少[10]。本試驗發現，造模后小鼠在新異環境中的自主行為和探究行為均顯著下降，且黑質區TH 熒光強度明顯減弱，說明小鼠出現了PD的運動功能障礙相關癥狀及DA能神經元丟失，提示PD小鼠模型制備成功；而Sch B干預可以保護MPTP誘導的PD小鼠黑質DA能神經元，并改善其運動功能。

盡管PD的病因還未完全解析，但氧化應激是公認的與PD發病密切相關的重要因素。氧化應激發生于細胞的氧化還原活性失調之時，ROS的產生超過了機體的清除能力從而大量蓄積，導致神經細胞受到氧化損傷，功能和結構的完整性被破壞而死亡。氧化應激是PD初始階段的一個重要特征，來自PD早期患者的臨床數據顯示，在大量DA能神經元丟失之前，機體的氧化應激水平已經升高，提示過量ROS的產生是DA能神經元死亡的潛在致病因素，而非進行性神經退行變性的繼發應答[11]。SOD和GSH是體內自由基的有效清除劑，SOD的活性和GSH的含量可作為衡量機體抗氧化能力的重要指標；CAT能夠清除體內過氧化氫，其酶促活性為機體提供了抗氧化防御機理；MDA作為脂質過氧化產物，其含量反映了機體受氧化損傷的程度。本試驗結果顯示，MPTP誘導的PD小鼠腦組織中SOD、CAT活性和GSH含量顯著下降，MDA含量明顯上升，說明PD小鼠腦內發生了氧化應激，導致氧化產物積累。而Sch B干預則明顯提高了SOD、CAT活性和GSH含量，并有效減少了MDA產生，提示Sch B能夠提高PD小鼠腦內抗氧化能力，減少脂質過氧化發生，從而緩解氧化應激對DA能神經元的損傷。

神經營養因子是對中樞和外周神經元的發育、增殖、存活和再生具有促進作用的一類生長因子。在PD患者和模型動物體內，多種神經營養因子的減少提示它們與PD的發生發展密切相關[3，12-13]。BDNF是腦中含量最多的一種神經營養因子，已被證明可以促進發育中的中腦DA能神經元存活，并保護純培養的中腦DA能神經元免受1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)的毒性作用[14]。將BDNF注入大鼠黑質可部分逆轉PD大鼠DA能神經元的丟失，多種藥物對PD模型動物的保護作用也均與調節BDNF表達有關[15-16]。CDNF是近年來發現的一種神經營養因子，在6-OHDA誘導的PD大鼠模型中，CDNF可改善PD的運動功能障礙，增強神經干細胞向損傷紋狀體的增殖和遷移，并有效保護中腦DA能神經元[17-18]；在MPTP誘導的PD小鼠模型中，同樣觀察到CDNF對損傷的黑質紋狀體系統具有神經保護和神經修復作用[19]。本試驗檢測到PD小鼠腦內BDNF和CDNF顯著下調，而Sch B可以有效上調BDNF和CDNF含量，提示Sch B可以促進神經營養因子分泌，在一定程度上改善PD小鼠腦內的神經營養狀態，從而促進DA能神經元存活。目前，人類已經開啟了神經營養因子干預PD的前期臨床研究，促進神經營養因子表達有望成為治療PD的新策略[20]。

綜上所述，Sch B對MPTP誘導的PD小鼠具有神經保護作用，這可能是通過提高腦內抗氧化能力、改善神經營養狀態實現的，但其中涉及的具體分子機制還有待進一步研究。