PI3K/AKT介導的凋亡信號通路在百草枯中毒致心臟損傷中的作用

李玉華，袁媛，王韞文，趙敏

百草枯(paraquat，PQ)是一種高效廣譜、廉價的非選擇性接觸性除草劑，其中毒是全球范圍內最主要的中毒事件之一，且目前沒有特效解毒藥物和治療方案。PQ攝入對包括人類在內的哺乳動物具有劇毒，可損傷多器官，包括肺、腎、肝、心臟和神經系統等，導致全身多器官功能衰竭甚至死亡，其中心臟損傷是百草枯中毒死亡的重要原因之一[1-6]。目前關于PQ毒性作用的機制尚未完全闡明，但既往有報道表明該化學物質會導致氧化應激反應及由此誘發的炎性級聯反應[1]。過量活性氧自由基的釋放及氧化應激可誘導細胞大分子的氧化修飾，抑制蛋白質功能，并最終促進細胞凋亡[7]。磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)是人體內重要信號轉導通路之一，在調控細胞代謝、生長發育、增殖凋亡等過程中發揮著重要作用[8]。該信號通路通過直接或間接調控凋亡相關因子參與細胞凋亡的不同階段，使其與心血管疾病發生發展過程中心肌細胞凋亡程度密切相關，在心肌細胞存活和程序性死亡的過程中發揮關鍵的調控作用[9]。PQ中毒誘導的心臟毒性損傷可破壞心肌細胞的氧化抗氧化平衡，造成心肌細胞內活性氧(ROS)的蓄積，引起氧化應激反應，導致心肌細胞凋亡和壞死，大量心肌細胞壞死和凋亡進一步加重心臟損傷的嚴重程度[10]。目前，對于PQ誘導心肌細胞氧化應激反應導致細胞凋亡的機制研究尚不完善，本研究旨在探討PI3K/AKT介導的抗凋亡信號通路在百草枯中毒心臟損傷過程中的作用機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物:清潔級雄性SD大鼠20只，體質量250～300 g，由中國醫科大學實驗動物中心提供。適應性飼養1周，室內溫度20～25℃、濕度40%～70%，晝夜節律12 h，自由進食水。(2)試藥試劑：百草枯(美國Sigma-Aldrich公司)，肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒(南京建成生物公司)；β-actin抗體(美國Proteintech公司)，PI3K和p-PI3K抗體(美國Affinity Bioscience公司)，AKT、p-AKT、Bax(美國Cell Signaling technology公司)，Bcl-2、Caspase-3(美國Abcam公司)；其余均為進口或國產分析純化學試劑。(3)儀器設備：生物組織石蠟包埋機、組織脫水機、烘片機、全自動組織染片機(德國Leica公司)、全自動輪轉切片機(美國Thermo公司)；光學顯微鏡(日本Nikon公司)；酶標儀(美國BioTek公司)；化學發光成像系統(美國UVP公司)。

1.2 實驗方法 2019年7月—2020年1月于中國醫科大學附屬盛京醫院本溪基地實驗中心進行實驗， 并經過中國醫科大學動物倫理委員會批準。雄性SD大鼠20只隨機數字表法均分為2組，每組10只。百草枯中毒組(PQ組)：按照百草枯20 mg/kg腹腔注射；對照組(CON組)：等體積生理鹽水腹腔注射。 2組大鼠于腹腔注射48 h后，以10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉。將大鼠仰臥位固定于鼠臺上，常規消毒后，打開胸腔及腹腔，暴露胸、腹腔內各臟器，并觀察心臟、肺臟、肝臟、腎臟的形態學變化；經大鼠腹主動脈采血2 ml，經室溫靜置>2 h后，4℃離心收集上清液置于-80℃保存備用；而后無菌條件下迅速剝離心臟，放入冰生理鹽水中，除去雜質及脂肪，洗凈殘留的血液，并用濾紙吸干多余水分；部分心臟置于-80℃保存以備檢測，部分置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h以上，以備HE病理染色檢測，觀察心肌組織結構。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 心臟組織損傷觀察：上述4%多聚甲醛溶液中固定48 h以上的心臟，經梯度脫水石蠟包埋，連續切片厚度5 μm，并行HE染色，然后將切片脫水并固定，封片后在光學顯微鏡下觀察心肌組織結構。

1.3.2 心肌酶檢測：(1)CK、 LDH活性，上述大鼠腹主動脈采血2 ml離心留取血清，使用CK、LDH測定試劑盒并嚴格按照說明書檢測血清CK和LDH活性，評估心肌細胞損傷；(2)SOD、MDA吸光度，取心臟組織100 mg攪碎后溶于緩沖液中做成5%組織勻漿，采用BCA法測定SOD和MDA。根據SOD、MDA試劑盒說明書，使用96孔板在460 nm測量組織勻漿中SOD、MDA的吸光度值。整個過程嚴格按照SOD和MDA檢測試劑盒說明書執行。

1.3.3 心臟組織相關蛋白表達：使用Western-blot法檢測組織細胞總蛋白。取上述置于-80℃保存的部分心臟組織，在含有蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的冰冷RIPA裂解液中充分研磨剪碎以制備組織勻漿，BCA法檢測總蛋白濃度；進行蛋白定量后，加樣品緩沖液煮沸5 min，各取5 μl加樣，使用10%聚丙烯酰胺凝膠通過SDS-PAGE電泳分離蛋白質，將其轉移至PVDF膜上；5%脫脂牛奶或5%BSA封閉液封閉2 h，并使用對應的抗體按說明書推薦濃度比例在4℃過夜；用含0.1%TWEEN-20的TBST沖洗10 min (3次)，然后在室溫下與相應的二抗(1∶5 000)孵育1 h，使用ECL發光液進行可視化顯影，測得各條帶的灰度值，以β-actin為內對照標準化后，比較心臟組織PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達量。

2 結 果

2.1 2組心臟組織病理學變化比較 與對照組比較，PQ組大鼠在中毒后心肌出現明顯的病理變化，心肌纖維排列紊亂、腫脹，心肌細胞核腫脹或消失，染色變淡，見圖1。

圖1 各組大鼠心臟組織病理學變化(HE染色，×200)

2.2 2組血清CK、LDH水平比較 與對照組比較，PQ組血清CK和LDH水平均升高(P均<0.001)，見表1。

表1 2組大鼠血清心肌壞死標志物CK和LDH水平比較

2.3 2組心臟組織SOD和MDA水平比較 PQ組大鼠心臟組織SOD水平較對照組降低，而MDA水平較對照組明顯上升(P<0.001)，見表2。

表2 2組大鼠心肌細胞氧化損傷指標SOD和MDA水平比較

2.4 2組心臟組織相關蛋白表達比較 PQ組大鼠心臟組織p-PI3K、p-AKT、Bcl-2蛋白表達和Bcl-2/Bax較對照組均顯著下降，而Bax、Caspase-3蛋白表達量明顯增加，差異均具有統計學意義(P均<0.01)，見圖2、表3、表4。

圖2 各組大鼠心臟組織中相關蛋白表達水平比較

表3 2組大鼠心臟組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白相對量表達比較

表4 2組大鼠心臟組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相對量表達比較

3 討 論

目前，關于百草枯中毒導致心臟損傷及損傷相關的生物學機制尚未闡明，但迄今認為百草枯中毒誘發機體的氧化應激及相應的級聯炎性反應是導致多器官功能衰竭的重要原因。百草枯具有較強的氧化還原特性，在體內經還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、黃嘌呤氧化酶等的綜合作用下，產生大量的過氧化物陰離子，體內ROS、氮類物質增加，抗氧化酶系消耗，導致細胞對氧化應激的敏感性增高，使機體處于氧化應激狀態，引起線粒體損傷、脂質過氧化反應、細胞內鈣超載、DNA損害、炎性反應、細胞增殖及凋亡等[10-12]。PQ中毒后誘導心臟損傷并減弱心肌細胞的收縮功能，該毒性作用與ROS的增加有關，且伴隨氧化應激、凋亡、鈣超載、炎性反應、自噬等多種病理過程[13-14]。目前研究數據表明，百草枯急性暴露引起的心臟毒性損傷，表現為心臟組織結構完整性破壞，心肌細胞壞死標志物CK及LDH水平顯著升高。同時，PQ暴露破壞了心肌細胞氧化與抗氧化的平衡狀態，心肌抗氧化能力不足，表現為PQ組大鼠心臟組織中抗氧化物SOD活力水平較對照組明顯下降，而促氧化物MDA水平顯著增加。因此，氧化應激參與了PQ導致的心臟毒性損傷過程，且心肌細胞內ROS的蓄積，引起氧化應激反應，導致心肌細胞凋亡和壞死，大量心肌細胞壞死和凋亡又進一步加重心肌細胞損傷的嚴重程度[14-15]。

細胞凋亡是各種生物體內較常見的細胞死亡方式，在心血管疾病中發揮關鍵作用，如缺血/再灌注損傷、高血壓和糖尿病性心肌病等[16-17]。PI3K/AKT是一種廣泛的信號傳導途徑，可參與機體多種細胞生物學過程[18]。該信號通路可被細胞內外各種病理或應激刺激而激活，如炎性反應、缺血、缺氧和氧化應激，多項研究表明，該信號通路對缺血再灌注和多種藥理介質誘導的氧化應激及炎性反應具有保護作用[19-21]。AKT是PI3K的關鍵下游介質之一，活化的PI3K將膜結合的磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)轉化為磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)，PIP3作為細胞內的第二信使可結合并活化PI3K下游的信號蛋白AKT[22]。AKT作為強有力的Bad激酶，其活化后可使Bad位點磷酸化，磷酸化Bad(失活態)使Bcl-2或Bcl-XL游離，發揮抗凋亡作用。同時，活化的AKT還可抑制Caspase-3的級聯活化，促進細胞存活[23-26]。本實驗結果表明，急性百草枯中毒顯著抑制了PI3K及AKT的磷酸化，從而顯著降低了抗凋亡蛋白Bcl-2水平，而促凋亡蛋白Bax和Caspase-3水平則升高。結果與既往研究報道一致，PI3K/AKT通路作為控制心肌細胞存活和功能的重要促增殖及抗凋亡信號通路之一，在心肌細胞存活和程序性死亡的過程中發揮著關鍵的調控作用[9]。

總之，百草枯中毒可以通過氧化還原反應及誘發的炎性級聯反應等一系列復雜的生物學過程抑制PI3K/AKT信號通路的激活，進而抑制該通路下游抗凋亡蛋白Bcl-2的分離和表達，促進心臟組織的損傷和心肌細胞的凋亡。因此，PI3K/AKT介導的Bcl-2抗凋亡信號通路在百草枯中毒誘導心臟損傷的過程中發揮極其重要的生物學作用。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

李玉華：設計研究方案，實施研究過程，資料收集整理，分析實驗數據，論文撰寫，論文修改；袁媛、王韞文：資料收集整理，論文修改；趙敏：提供研究方向、研究思路，研究選題，設計研究方案，修訂論文，論文終審