內源性大麻素抗肺纖維化的作用研究進展

喻娟娟綜述 歐維琳審校

內源性大麻素系統主要由大麻素受體(CBR)、大麻素及合成與降解內源性大麻素的酶組成[1]。生物體內主要的大麻素受體是大麻素Ⅰ型受體(CB1R)、大麻素Ⅱ型受體(CB2R)，它們都是G蛋白偶聯受體，大麻素發揮生物活性效應的主要化學物質是△9-四氫大麻酚(△-THC)。現有研究證實，內源性大麻素可通過與受體結合觸發不同的信號傳導通路，發揮多種病理生理作用，主要通過免疫系統調節炎性反應，抑制炎性細胞釋放炎性因子，如對肝炎、肺部炎性反應、結腸炎等炎性調節作用[2-4]。纖維化是組織被炎性反應等刺激后發生的一種修復或反應的病理過程，主要表現為纖維結締組織的過量形成和沉積，最終導致組織器官結構和功能的不可逆性損傷，文獻報道，內源性大麻素對心肌梗死后心肌纖維化、肝硬化、腎纖維化等有抗纖維化作用[5-7]。大多數呼吸系統疾病因呼吸道炎性反應反復發生最終發展成肺纖維化，其發病機制復雜，尚不完全清楚，其中一個重要病變過程是長期反復炎性反應刺激導致氣道重構，肺功能發生不可逆損害，國際上暫時還沒有有效逆轉肺纖維化的藥物。內源性大麻素經其代謝途徑抑制炎性反應，逆轉氣道重構延緩肺纖維化的研究值得人們關注，大麻素受體或許是治療肺纖維化的一個新靶點。文章就內源性大麻素及其抗肺纖維化作用機制與調節通路進行綜述。

1 內源性大麻素概述

1.1 內源性大麻素及大麻素受體 Di Marzo和Fontana等最先提出內源性大麻素系統由內源性大麻素、大麻素受體，以及涉及內源性大麻素合成、運輸和降解的酶所構成。內源性大麻素主要通過2種特異性大麻素受體發揮作用即CB1R和CB2R，CB1R和CB2R均為G蛋白偶聯受體(GPCRs)(Gi/o)，這2種受體主要通過7次跨膜發揮生物學效應。CB1受體主要分布在神經系統、神經末梢和脂肪組織等多種組織中，CB2主要在具有免疫功能的外周器官中表達，如扁桃體、脾臟、胸腺、骨髓、肺、肝臟[8-11]。CB2R主要依賴K+通道和Ca2+通道，對內源性大麻素在體內的代謝進行調節。

1.2 內源性大麻素活性成分 1964年Gaoni和Mechoulum首次提取出大麻素發揮生物學效應的主要分子Δ9-四氫大麻酚(THC)，1992年在哺乳動物豬腦中分離出的第一種內源性大麻素相關物質N-花生四烯酸乙醇胺(N-AEA)。在隨后幾年中，人們發現了多種活性內源性大麻素物質，主要是花生四烯酸與乙醇胺或甘油結合的衍生物，2-花生四烯酸甘油乙醚、O-花生四烯酰乙醇胺及N-花生四烯酰多巴胺等[12-13]。

2 內源性大麻素抗肺纖維化的機制

2.1 參與免疫調節 內源性大麻素及其受體在免疫系統表達并參與免疫調節作用[14]，如CB2受體參與B細胞分化、巨噬細胞遷移和抗原處理，大麻素受體通過產生一氧化氮(NO)和前列腺素E2(PGE2)參與肥大細胞活化。過去大多數研究都集中在內源性大麻素系統對中樞神經系統的影響上，但其在免疫、心血管、胃腸道和呼吸系統中具有多種生物學效應[15]。近年來研究表明具有免疫調節功能的內源性大麻素系統是治療炎性疾病及纖維化疾病的靶點之一[16]。文獻報道，CB2R通過參與B細胞分化、巨噬細胞遷移和磷酸化、抗原處理在免疫調節中發揮抗炎作用。內源性大麻素和大麻素受體的激活可通過減少炎性細胞的募集和增加抗炎細胞因子的產生來抑制肝炎、肺炎、結腸炎中的炎性反應[2-4]。有研究表明，用CB2R激動劑HU308對小鼠盲結腸穿孔引起的膿毒癥進行干預，結果表明CB2R激動劑HU308可減輕脂多糖對巨噬細胞的刺激，使促炎因子TNF-α、IL-18、IL-1β和NLRP3的表達降低[14]，說明CB2R通過抑制巨噬細胞釋放促炎因子減輕肺部炎性反應損傷。

2.2 降解膠原纖維 纖維化的一個主要病理改變是基底膜增厚，基底膜由大多數上皮細胞和內皮細胞的細胞外基質構成[17]，細胞外基質和膠原沉積是基底膜增厚的一個重要表現，在各種生物學過程中發揮著重要作用，特別是在實質損傷后的組織重構中。肺組織細胞外基質的大分子由肺成纖維細胞(FB)分泌的纖維蛋白(膠原蛋白、彈性蛋白)、結構蛋白或黏附蛋白(纖維連接蛋白和層粘連蛋白)組成[18]，這些組成細胞外基質的大分子物質嵌合在透明質酸(HA)等糖胺聚糖的水合多糖凝膠中。成纖維細胞在炎性介質刺激下轉變為肌成纖維細胞，肌成纖維細胞是Ⅰ型膠原蛋白(ColⅠ) 和纖維連接蛋白(FNⅠ)的主要來源，Col Ⅰ被認為是氣道重構的早期標志，是體內含量最豐富也是分布最廣泛的膠原，Col Ⅰ的沉積可引起氣道壁增厚和僵硬[19-20]。FN 是一種黏附性糖蛋白，在 Col Ⅰ合成之前就已經產生，能夠刺激上皮細胞、成纖維細胞等細胞產生膠原纖維，不僅使大、小氣道內膠原纖維增多，而且高度紊亂、碎片化參與氣道重構[21]。大麻素受體的激活可以降解膠原纖維，心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)是心肌細胞受損后發生間質化且伴隨大量膠原纖維的沉積導致心臟結構重構，可引起慢性心功能不全、惡性心律失常等事件的發生，并出現心功能進行性衰竭[22]。研究表明，內源性大麻素系統中CB2 受體激活可促進干細胞(如造血干/祖細胞和神經祖細胞)的增殖，心臟祖細胞激活和增殖在心肌梗死后心肌內源性再生和修復中發揮重要作用。用CB2 受體激動劑AM1241干預通過調節PI3K/Akt/Nrf-2信號通路促進心肌梗死后心肌內源性再生,改善心臟功能和心臟結構重構,近年來用大麻素受體激動劑AM1241干預心肌梗死后心肌纖維化的研究發現，CB2受體激活可降低心臟組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖維粘連蛋白、金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)，同時還發現大麻素受體激動劑AM1241可抑制缺氧狀態下心肌成纖維細胞的分泌和轉型，從而改善心肌重構改善心肌纖維化[6]。

2.3 抑制成纖維細胞分泌 肺成纖維細胞在肺纖維化的發生過程中起著重要的促進作用，主要通過自身的異常增殖與轉型，大量分泌細胞外基質直接觸發肺纖維化和作用于上皮細胞及一些炎性細胞間接參與肺纖維化進程。隨著成纖維細胞數目的不斷增加，肺部成纖維灶逐漸形成，并且逐漸取代正常的肺細胞組織，這是肺成纖維細胞通過細胞增殖轉型引起肺部結構的異常重構，進而觸發肺纖維化。但是在肺纖維化過程中部分成纖維細胞灶的細胞可能由其他肺部細胞如上皮—間質轉化而來，肺泡上皮細胞向間質細胞轉化。腎小管上皮細胞向腎纖維細胞轉化導致腎纖維化的發生。腎臟中存在一個完整的內源性大麻素系統，內源性大麻素系統激活后抑制成纖維細胞分泌，降低腎組織成纖維的含量，腎臟纖維化是炎性反應刺激或免疫等因素所致腎間質膠原大量沉積、瘢痕化的一種病理表現，其纖維化的病因與肺纖維化的主要病因類似，都存在上皮間質轉化途徑。內源性大麻素系統有抗腎纖維化的作用，文獻報道[7]，腎臟內源性大麻素系統通過CB2R在炎性細胞或實質細胞上的信號傳導產生抗炎作用并降低炎性反應引起的纖維化，而通過CB1R的信號傳導促進氧化應激和炎性反應，導致細胞凋亡和纖維化，CB1R和CB3R之間可能存在相互制約的作用。在Ⅰ型糖尿病腎病、慢性腎纖維化、藥物性腎小管損傷的動物模型中，當CB1R信號高于CB2R時導致氧化應激和炎性反應，隨后出現細胞功能障礙、調亡和纖維化，而抑制CB1R激活CB2R可減少炎性反應和纖維化的發生。大麻素Ⅱ型受體通過抑制巨噬細胞釋放促炎因子減輕組織炎性反應，通過降低膠原蛋白、纖維粘連蛋白、抑制成纖維細胞的分泌改善組織重構延緩纖維化的發生。

2.4 調控平滑肌細胞增生 氣道平滑肌細胞發生增生、肥大、遷移和凋亡抑制，同時表達和釋放細胞因子、生長因子及蛋白酶類，可導致上皮下基膜增厚和細胞外基質沉積，引起氣道重構，是最終引起肺功能下降的主要原因。在肝纖維化中，內源性大麻素系統同樣發揮抗纖維化的作用，肝纖維化是由多種原因導致的慢性肝損害，肝星形細胞和肌成纖維細胞在損傷區域增生、聚集，合成并分泌平滑肌肌動蛋白及促纖維發生的細胞因子,如轉化生長因子(TGF-p1)和生長因子。在中國慢性乙型肝炎是最主要致病原因，在歐美國家慢性酒精性肝炎是肝纖維化的主要原因，若損傷因素長期不能去除，肝纖維化會持續發展，長期慢性刺激導致細胞外基質過度沉積和纖維化瘢痕形成[23]，纖維組織逐漸增多取代原有肝細胞、破壞其正常結構，最終致肝纖維化。Munoz-Luque等[24]用CB2R激動劑JWH133干預CCL4誘導的大鼠肝硬化，可以降低大鼠肝組織單核細胞浸潤、肝細胞凋亡、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達、膠原含量和基質金屬蛋白酶(MMP)-2的含量，最終減少肝纖維化的發生。結果表明，CB2R激活后抑制炎性反應因子釋放，抑制平滑肌細胞增生最終減少肝纖維化的發生。這可能是內源性大麻素通過調控平滑肌細胞增生抑制肺纖維化的發生。

2.5 調控基質金屬蛋白酶表達 氣道基底膜增厚是氣道重構的特征性改變，上皮下基質金屬蛋白大量沉積—纖維化，是哮喘氣道重構的重要組成部分[25-26]。基質金屬蛋白酶(MMP)是一個鋅依賴性分泌家族，它們能夠降解基質的主要成分，如膠原蛋白、明膠和蛋白多糖?；|金屬蛋白酶以潛伏形式分泌后，基質金屬蛋白酶原酶被基質金屬蛋白水解酶激活，其活性形式與特異性抑制劑基質金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)相互作用，調節肺癌和急慢性炎性疾病(包括COPD、間質性肺纖維化)的病理生理。在基質金屬蛋白酶家族中，基質金屬蛋白酶-2、明膠酶A、基質金屬蛋白酶-9、明膠酶B對基底膜的重要組成部分Ⅳ型膠原具有切割作用。細胞轉化生長因子-β1(TGF-β1)通過調節HTFs中MMPs和TIMP的表達，顯著提高纖維粘連蛋白和膠原蛋白的生成。CB2R激動劑HU308和JWH133改善了TGF-β1誘導的纖維連接蛋白、Ⅰ型和Ⅲ型膠原的生成，以及MMP-1和MMP-3的表達，降低細胞外基質的重構、纖維粘連蛋白和Ⅰ型膠原在瘢痕形成中起重要作用[27]。因此，大麻素受體激活后可以調控基質金屬蛋白酶表達進而干擾纖維化疾病的發展。

3 內源性大麻素抗肺纖維化的作用

氣道炎性反應和氣道重構是支氣管哮喘2個主要病理學特征[28]。氣道平滑肌增厚等病理學表現是哮喘氣道重構的一個重要特征，氣道重構是肺纖維化的一個重要病變過程，常由于反復慢性炎性反應損傷和修復而引起氣道壁結構改變，導致肺功能不可逆轉損害，肺纖維化的病理改變主要包括間質纖維化、炎性細胞浸潤、上皮細胞增生、膠原纖維增生、平滑肌增生、纖維結締組織增生[29]。內源性大麻素系統抗心肌纖維化、抗肝纖維化的研究已經得到證實，近年來關于內源性大麻素系統抗肺纖維化的研究逐漸被人們關注，有研究證實[30]，用內源性大麻素干預OVA誘導的過敏性哮喘小鼠可降低小鼠氣道阻力，減少氣道和肺間隔的膠原含量，減少嗜酸性粒細胞及炎性介質IL-4、IL-5、IL-13、eotaxin的釋放，該研究表明，內源性大麻素系統可抑制氣道炎性反應，降低氣道和肺間隔膠原含量，逆轉氣道重構延緩肺纖維化的發生。

在百草枯中毒致大鼠急性肺損傷的實驗中，用JWH133處理后可以減輕肺組織損傷程度，降低支氣管肺泡灌洗液中IL-1β和TNF-α水平，減少肺組織中NF-κB 和AP-1蛋白的表達，從而減輕百草枯所致的肺纖維化。文獻報道[17]，用CB2R拮抗劑AM630干預尼古丁誘導的肺纖維化小鼠模型后，小鼠肺泡腔厚度增高，而且肺間質充血，肺結構破壞，Ⅱ型肺泡細胞增生和間質纖維化，該組結締組織生長因子(CTGF)和α-SMA表達最高，而用JWH133 干預尼古丁誘導的肺纖維化小鼠模型后肺組織結構正常，肺泡間隔最薄。即當CB2R被抑制時肺纖維化程度加重，當CB2R被激活時肺纖維化程度減輕。這一研究表明，內源性大麻素系統中大麻素Ⅱ型受體被激活能降低氣道阻力，減少炎性細胞浸潤，降低炎性因子釋放，抑制氣道炎性反應，能減輕肺組織損傷程度，降低氣道和肺間隔的膠原含量，抑制結締組織和新生血管的形成延緩肺纖維化的發生。

一項關于CB2受體激動劑JWH133和抑制劑SR144528對卵蛋白誘導大鼠氣道重構影響的實驗結果顯示，CB2受體激動劑JWH133可以降低卵蛋白誘導的大鼠氣道重構肺組織病理損傷，減少肺組織膠原纖維沉積，降低肺泡灌洗液中血管內皮生長因子的表達，降低肺組織基質金屬蛋白酶蛋白表達，對卵蛋白誘導的大鼠氣道重構有保護作用，CB2受體抑制劑SR144528對卵蛋白誘導的大鼠氣道重構沒有保護作用。因此，在外周可能主要是大麻素Ⅱ型受體發揮抗纖維化的作用。

4 內源性大麻素抗肺纖維化的調節通路

4.1 磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶(PI3K/Akt)信號通路 既往研究發現，磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶(PI3K/Akt)信號通路在肺部炎性反應方面起重要作用，該通路是對細胞增殖、分化、調亡及衰老進行調節的關鍵信號通路之一，Akt在各種纖維化組織中被上調，在炎性分子刺激下，PI3K和Akt磷酸化并被激活，進而通過轉錄調節細胞的生存、遷移和應激反應。近幾年有研究表明，抑制成纖維細胞的PI3K酶可減少TGF-β1誘導的成纖維細胞分化和膠原蛋白的產生。有文獻報道用CB2R激動劑JWH133干預肺缺血再灌注損傷的動物模型，可以減輕小鼠肺水腫和肺組織病理學改變，還可以提高肺組織氧合指數(PaO2/FiO2)，降低肺組織炎性因子TNF-α、IL-6的表達，提高過氧化物酶(SOD)的活性，而用CB2R拮抗劑AM630干預后CB2受體被激活保護肺缺血再灌注損傷的作用被阻斷，用PI3K抑制劑LY294002干預后CB2R對肺缺血再灌注損傷的保護作用也被阻斷，這一研究表明，在不改變CB2R表達的情況下下調p-AKT表達可以阻斷CB2R對肺缺血再灌注損傷的保護作用，PI3K/Akt通路可能參與了內源性大麻素系統在減輕肺部炎性反應方面的作用[27]。該通路通過減輕肺部炎性反應，延緩氣道重構的發生并達到抗肺纖維化的作用。

內源性大麻素系統能抑制肺巨噬細胞釋放血管生長因子(VEGF-A)、淋巴管生長因子(EVGF-C)，研究發現肺巨噬細胞可以產生2-花生四烯醇甘油、N-花生四烯醇乙醇等內源性大麻素，同時巨噬細胞還表達CB1R、CB2R。當予CB1R激動劑ACEA、CB2R激動劑JWH133干預后，脂多糖(LPS)誘導巨噬細胞釋放的VEGF-A、VEGF-C減少，該研究表明在肺巨噬細胞內存在一個完整的內源性大麻素系統，當加用鈣螯合劑EGTA后巨噬細胞產生內源性大麻素的效應被抑制，說明內源性大麻素的產生呈鈣依賴性。用大麻素受體激動劑干預后巨噬細胞外調節蛋白激酶(ERK1/2)磷酸化上調和活性氧(ROS)生成增加[31]。巨噬細胞是免疫反應和組織重構的關鍵效應細胞，通過產生廣泛的介質，包括血管生成和淋巴管生成因子調節血管和組織重構，在氣道重構中，激活肺巨噬細胞的大麻素受體可能是一種新的調節巨噬細胞逆轉重構的靶點。

4.2 TGF-β1/Smad3信號通路 TGF-β1是目前發現的促纖維化作用最強的生長因子，其可刺激 PASMCs 發生表型轉換并過度分泌細胞外基質，主要成分為Col Ⅰ、Col Ⅲ，引起肺動脈中膜層增厚，從而導致了肺血管重構[32]。Smad3 蛋白是 TGF-β1下游重要的信號分子之一，當 TGF-β1與其配體結合后可介導Smad3 蛋白磷酸化，調控相關基因的轉錄和翻譯，促進膠原蛋白合成。吡非尼酮是FDA目前推薦的治療特發性肺纖維化的兩大藥物之一，有顯著抗肺纖維化的作用，吡非尼酮能降低血清炎性因子水平，抑制成纖維細胞增殖，顯著改善博來霉素誘導的肺纖維化，當予CB2R拮抗劑SR144528進行干預后，吡非尼酮的這種抗纖維化作用減弱，CB2R可能是吡非尼酮抗纖維化作用的靶點[33]。有研究發現，吡非尼酮通過促進Sirt1從而調控TGF-β1/Smad3信號通路來抑制肺纖維化。CB2R在抗肺纖維化中的作用通路可能也包括TGF-β1/Smad3信號通路。經上述2種信號通路的初步研究表明，激活CB2R能抑制巨噬細胞外調節蛋白激酶ERK1/2的磷酸化，能抑制Smad3相關蛋白的表達，提示CB2R在抗肺纖維化中的作用可能與上述2種信號分子介導的調節通路有關。

綜上所述，近年來關于內源性大麻素系統在心臟、肝臟、腎臟等組織抗纖維化的研究已經逐漸被人們認識，但是目前國內外關于內源性大麻素系統抗肺纖維化的作用研究還處于動物實驗階段，由于肺纖維化的發生機制復雜，參與因素眾多，目前治療仍然沒有突破性的進展,關于內源性大麻素系統抗肺纖維化的研究值得關注，大麻素受體可能是治療肺纖維化的新靶點，能為進一步認識肺纖維化的發病機制及治療提供新的方向和證據。