基于DNA條形碼技術對朝鮮牛黃安宮丸中犀牛角成分鑒別的研究

王殿夫，齊 欣，李長征，劉洪偉，麻麗丹*，楊希國

(1.遼東學院，遼寧 丹東118000；2.大連海關技術中心，遼寧 大連 116000；3.大東港海關，遼寧 東港 118300；4.丹東海關，遼寧 丹東 118000；5.遼寧通正檢測有限公司，遼寧 沈陽 110026)

0 引言

犀牛曾遍布地球，但由于偷獵及棲息地被破壞的原因，從70年代至今世界上的犀牛種群至少下降了85%[1].目前世界上僅存的犀牛共包含5個物種，即蘇門達臘犀(Dicerorhinussumatrensis)，非洲的白犀(Ceratotheriumsimum)和黑犀(Dicerosbicornis)，以及亞洲的印度犀(Rhinocerosunicornis)、爪哇犀(Rhinocerossondaicus)[2].犀牛角早在《本草綱目》、《神農本草經》和《藥性本草》等藥典中有過明確的記載，作為一種珍貴稀有的藥材，具有瀉火解毒、涼血止血、清心安神及治療癌癥的功效[3-7].而造成物種極度瀕危狀態的根源是犀牛角的珍貴[8].1977年起《瀕危野生動植物種國際貿易公約》(CITES)將所有現存犀牛物種列入其附錄Ⅰ的監管范圍[9-10].1993年5月，我國國務院發布的《關于禁止犀牛角和虎骨貿易的通知》(國發[1993]39號)中嚴令禁止犀牛角的進出口及用其制藥[11].近年來，由于犀牛角的稀少和珍貴使其價格飆升，犀牛的盜獵、非法貿易和走私等現象仍然有發生，更有一些不法分子為了牟取巨額利潤用家畜角制品來仿制加工，以冒充真正的犀牛角[12].現市場上涉及的角骨類入藥藥材，由于其難以提取，造成了其鑒定工作的困難，無法配合質檢、海關及公安部門的仲裁工作.因此，急需建立犀牛角制品準確、快速的鑒定方法，為各執法部門提供技術支持[13].隨著分子生物學的發展，DNA條形編碼(DNA Bar-coding)技術已成為一種新興的生物分類學方法，具有廣泛的應用前景，不僅不受樣本形狀、形態等條件限制，也逐漸被應用于珍貴藥材成分的鑒定中，以建立高效的物種鑒別技術方法[14-19].同時動物角骨類藥材的條形碼多來自線粒體基因DNA和核基因.線粒體DNA不僅結構簡單、進化速度快，還嚴格按照母系遺傳，其控制區具有種群和個體的特異性，現已被國際上廣泛地應用于物種鑒定及系統進化等領域，也是藥物分子鑒定中DNA條形碼的重要來源[20].其中線粒體基因組中的12S rRNA基因，就被主要應用在物種鑒定中[21].目前尚未見采用12S rRNA基因鑒定角類藥材的相關報道.

朝鮮牛黃安宮丸是安宮牛黃丸的成品制劑.本研究以涉案的朝鮮牛黃安宮丸為材料，對其消化處理后提取DNA，采用12S rRNA作為DNA條形碼基因片段，通過PCR擴增、測序和比對分析，用于安宮牛黃丸中犀牛角成分的真偽鑒別方法，確定了安宮牛黃丸制品準確及便捷的核酸提取和物種鑒別方法，為規范國內和口岸安宮牛黃丸制品市場的監管，打擊非法貿易提供有效的技術支持.

1 材料與方法

1.1 材料

本研究材料來自于涉案的朝鮮牛黃安宮丸，產品共計13份.同時采用犀牛角和山羊角分別作為試驗陽性和陰性對照樣本.

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取

考慮角制品結構堅硬造成細胞膜不容易破碎，同時朝鮮牛黃安宮丸屬于深加工藥材，由于經過加工處理造成DNA降解和提取工作的困難，綜合以上原因需對材料進行前期消化處理.處理方法為：取檢材500 mg于50 mL離心管中，加入5 mL細胞裂解液(2%CTAB、100 mmoL Tris、1.4 mol/L NaCl、20 mmol/L EDTA、pH8.0)搖勻，充分混勻后55 ℃水浴中溫和震蕩消化過夜，置于65 ℃恒溫箱中溫育2 h.然后采用Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒提取動物組織基因組DNA.

1.2.2 PCR引物

采用合成12S rRNA 基因序列的通用引物對L1091/ H1478[22]對各檢材進行PCR擴增反應，通用引物序列如表1所示.

表1 PCR反應引物序列

1.2.3 PCR擴增反應體系及條件

每50μL PCR反應體系：5 μL 10×Ex Taq buffer(Mg2+plus)，4 μL dNTP Mixture(2.5 mmol/L)，0.25 μLTaKaRa Ex Taq(5 U/μL)，1 μL L1091(10 mol/L)，1 μL H1478(10 mol/L)，2 μL模板DNA，加ddH2O至50 μL.

PCR反應參數：98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，40個循環；72 ℃延伸10 min.

1.2.4 PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測

PCR 擴增反應結束后，將各PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，以DL2000 maker作為參照在凝膠成像系統下觀察電泳情況.

1.2.5 PCR產物測序

使用ABI 3500基因分析儀進行測序分析.每份檢材的PCR產物均進行雙向測序，以保證所測序列的準確性.

1.2.6 序列分析

檢材經測序后獲得正反兩條序列，采用DNA Star 軟件(DNA Star，Inc)中的Seq Man 程序對雙向測序結果進行拼接處理[23].序列使用美國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)[24]中的Blast程序進行相似性分析比對，分別確定檢材的基因序列號后以鑒別其物種種類.

2 結果與討論

2.1 PCR產物電泳結果

采用12S rRNA 基因序列合成的通用引物對犀牛角、山羊角和朝鮮牛黃安宮丸擴增產物分別進行電泳后，擴增片段如圖1至圖3所示.從圖1-3可知，犀牛角、山羊角及朝鮮牛黃安宮丸擴增產物分別得到約500 bp、450 bp和500 bp條帶清晰的擴增片段.由于朝鮮牛黃安宮丸本身制品為深加工產品，再加上其成分的復雜，13份涉案的朝鮮牛黃安宮丸中只有5份檢材(C-3～C-7)得到了目的性擴增片段.該通用引物L1091/ H1478對角制品類可以得到穩定、亮度高的目的片段，能滿足DNA條形碼技術在物種鑒定檢測上的基本試驗要求.

圖1 犀牛角PCR擴增電泳圖圖2 山羊角PCR擴增電泳圖

圖3 朝鮮牛黃安宮丸PCR擴增電泳圖

2.2 測序結果及分析

將各檢材的目的片段測序后，使用NCBI 的Blast 程序分別對其進行相似性的檢索及比對，只選取了各檢材相似序列的5個比對結果進行了列舉，結果見表2.其中犀牛角檢材(A1～A8)擴增產物序列與白犀(Ceratotheriumsimum)線粒體DNA的12S rRNA基因序列部分片段的一致性可高達100.00%，同時在比對結果中也發現犀牛角檢測擴增產物序列與黑犀(Dicerosbicornis)線粒體DNA的12S rRNA基因序列部分片段的一致性達96.25%，因此，自NCBI下載白犀和黑犀物種線粒體12S rRNA全序列同犀牛角檢材擴增產物序列進行比對，結果見圖4，由圖可以看出犀牛角檢材擴增產物序列和白犀(基因序列號：Y07726.1)12S rRNA基因部分序列比對結果完全一致，而和黑犀(基因序列號：FJ608807.1)12S rRNA基因部分序列比對結果存在16個堿基的差異，說明在犀牛物種中白犀和黑犀親緣關系很近，兩者特征序列相差不大，才造成犀牛角檢材擴增產物序列和黑犀12S rRNA基因序列的部分片段一致性達96.25%，犀牛角檢材應為犀牛物種中的白犀；山羊角檢材(B-1、B-2)擴增產物序列與山羊(Caprahircus)線粒體DNA的12S rRNA基因序列部分片段的一致性可高達99.51%；朝鮮牛黃安宮丸(C-3～C-7)擴增產物序列與非洲水牛(Synceruscaffer)線粒體DNA的12S rRNA基因序列部分片段的一致性可達98.84%.使用相似性檢索及比對后，結果顯示本研究收集的對照樣本犀牛角和山羊角均具有較好的序列匹配度，采用12s rRNA 基因所鑒定的物種與實際收集檢材一致，從而驗證角制品采用12S rRNA作為DNA條形碼基因片段進行物種鑒定結果的準確、可靠.在對照樣本正常的情況下，5份涉案的朝鮮牛黃安宮丸與非洲水牛線粒體DNA的12S rRNA基因序列部分片段一致性大于98%可信度的一般要求，因此物種鑒定的結果為含有的是非洲水牛成分.

表2 檢材中12S rRNA基因的序列相似性比對

圖4 犀牛角檢材與白犀、黑犀的線粒體基因組中12S rRNA基因部分序列比對圖

3 結論

由于犀牛角珍貴稀有、神奇的藥效和巨大的經濟價值，使犀牛物種瀕臨滅絕.在全球范圍內珍稀瀕危物種非法貿易被公認為是謀取超高額利潤的違法活動之一[25].中國始終支持禁止任何犀牛制品交易的禁令.因此，采用分子生物學方法精準鑒定藥材中是否含有犀牛角成分，在打擊非法貿易和確定物種來源的案件中具有及其重要的意義.

由于角制品本身高度角質化的特點就會增加試驗提取的難度，再將其加工后微量入藥，與其他中藥基原成分進行混合則更會造成基因組DNA含量的減少.本研究針對上述原因對檢材進行有針對性的消化處理后，采用試劑盒提取基因組DNA，已從13份涉案的朝鮮牛黃安宮丸中鑒定出5份檢材是否含有犀牛角成分.說明通過對檢材進行前期的消化處理過程可得到較好質量的DNA模板，提高針對角類藥材物種鑒別方法的靈敏度，而針對沒有得到目的擴增片段的涉案檢材，如何從其復雜繁多的成分中更有效地提取DNA將作為下一步研究工作的重點.通過測序、相似性檢索比對，表明采用位于線粒體上的12S rRNA基因序列的通用引物對L1091/ H1478可以準確地辨別出犀牛角制品的真偽.本研究中涉案的朝鮮牛黃安宮丸經DNA條形碼技術鑒定結果為非洲水牛(Synceruscaffer)，并非使用我國限制入藥的犀牛角.有研究表明水牛角和犀牛角均含有較多的Zn元素，為其可替代犀牛角提供了一定依據[26].針對角類制品及其藥材制品的物種鑒別，該方法的建立可以為各執法部門相關案件的物種鑒定和量刑提供準確可靠的依據，為珍稀瀕危物種的監管和打擊非法貿易提供技術支持，從而更好地保護珍稀瀕危動物犀牛，規范國內和口岸犀牛角制品及其藥材制品的市場.