松郁安神方對失眠大鼠基底核多巴胺和腺苷含量的影響

王秀峰 張瑜 曾雪愛 張一帆 黃俊山

(福建省中醫藥科學院，福州，350003)

失眠是睡眠障礙最常見的一種疾病，以睡眠時間不足或睡眠質量下降為特征，以入睡困難、易醒或醒后難以入睡為常見表現，臨床上失眠患者數量呈現逐年增長趨勢，長期的失眠會嚴重影響工作和生活[1]。中醫許多學者認為失眠的病機當以肝郁為首[2]，故治療失眠應以著重調理肝的功能為基礎，即遵照中醫的治則應該予以疏肝解郁安神之法。松郁安神方(SYF)是黃俊山教授臨床上使用疏肝安神法治療失眠的經驗方，療效確切，不良反應小。但是，SYF治療失眠的藥理機制還不是很明確，本研究通過失眠大鼠模型，給予SYF和西藥治療，以大鼠基底核組織中多巴胺和腺苷含量變化為切入點，探討松SYF防治失眠的作用機制，為豐富疏肝安神法治療失眠提供部分實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物 實驗選用SPF級Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠60只，體質量(220±10)g，由上海斯萊實驗動物有限公司提供。實驗動物生產許可證號：SCXK(滬)2017-0005，質量合格證號：20170005004461，飼養于福建省中醫藥科學院動物實驗室，恒溫(22±1)℃和12 h:12 h固定照明節律(08:00開燈)的環境下，并可自由攝取食物和水。

1.2 實驗藥物 中藥復方SYF由甘松10 g、郁金15 g、玫瑰花10 g、酸棗仁15 g、夜交藤30 g、生龍骨30 g(先煎)、珍珠母30 g(先煎)、丹參15 g組成[3]。中藥飲片購于鷺燕(福建)藥業股份有限公司。以上藥物一次性煎煮，分裝后-20 ℃保存備用。大鼠用量為成人6倍(按體質量計算)劑量，按15 mL/kg灌胃給藥，1次/d，給藥時間1周[4]。阿普唑侖片(批號：20190417)，購于福建省第二人民醫院。

1.3 主要試劑和儀器 Rat DA ELISA Kit(貨號：ml003201)和Rat Adenosine ELISA Kit(貨號：ml058881-C)購于mlbio公司。對氯苯丙氨酸(PCPA)(貨號：C6506-25G)購于Sigma公司。酶標儀(美國BioTek，800TS)。

1.4 失眠大鼠模型的建立 PCPA按300 mg/kg溶于弱堿性生理鹽水中，配制成混懸液，連續腹腔注射PCPA2d，建立大鼠失眠模型。實驗大鼠出現晝夜節律消失，白天活動增多，睡眠減少直至消失，進食及飲水增多等整體觀察與正常組有明顯不同表明造模成功[5]。

1.5 實驗大鼠的分組、給藥及取材 造模成功后分成以下幾組：對照組、模型組、SYF低劑量組、SYF高劑量組和西藥阿普唑侖組，每組大鼠12只。SYF低劑量組按8.5 g/kg灌胃給藥，1次/d，1周；SYF高劑量組按17 g/kg灌胃給藥，1次/d，1周。阿普唑侖用蒸餾水配制成混懸液，用量為0.04 mg/kg，灌胃給藥，1次/d，1周。對照組和模型組給予同等體積的生理鹽水灌胃，1次/d，共7 d。以上各組，均按15 mL/kg體質量灌胃。

實驗結束，將實驗大鼠用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(40 mg/kg)，腹主動脈取血5 mL裝到抗凝管中，離心取上清，分裝EP管中凍存備用。取血后，斷頭，剪開頭皮，用血管鉗揭去顱骨和硬腦膜，剪斷雙側視神經后用眼科鑷子迅速取出大鼠的整個腦組織。用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，置于液氮或-80 ℃保存備用。

1.6 神經遞質的檢測 神經遞質的檢測方法按照Rat DA ELISA Kit和Rat Adenosine ELISA Kit檢測試劑盒說明書進行。取所需檢測的大鼠血漿樣本各50 μL，不同濃度標準品各50 μL分別加入96孔酶標板中。標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100 μL，封板，37 ℃溫育60 min。然后洗板5次。每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入終止液50 μL，15 min內，450 nm測OD值，計算樣本的濃度。

2 結果

2.1 用藥前后實驗大鼠的一般情況差異 實驗期間對照組的大鼠，飲食沒有明顯的變化，體質量緩慢增加，睡眠活動正常，毛色有光澤，其他生理狀況正常。在造模和用藥期間，模型組大鼠的飲食增加，白天和夜間活動比對照組增加，睡眠減少，精神狀態差，煩躁，皮毛顏色欠光澤，體質量增長與對照組和觀察組差異有統計學意義。中藥復方SYF在改善失眠引起的癥狀上優于西藥阿普唑侖。

2.2 不同藥物處理對大鼠基底核組織中DA含量的影響 為了檢測不同藥物對實驗大鼠基底核組織中DA含量的影響，采用Rat DA ELISA Kit檢測用藥處理后各組大鼠基底核組織中DA含量。結果如圖1所示，與對照組大鼠基底核組織中DA含量比較，模型組大鼠基底核組織中DA含量顯著升高(P<0.01)，阿普唑侖組大鼠基底核組織中DA含量顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，阿普唑侖組、SYF高劑量組和SYF低劑量組大鼠基底核組織中DA含量均顯著下降(P<0.01)。同阿普唑侖組比較，SYF高劑量組(P<0.05)和SYF低劑量組(P<0.01)比較差異均有統計學意義。SYF高劑量組和SYF低劑量組之間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1 各組實驗大鼠基底核組織中DA含量比較

2.3 不同藥物處理對大鼠基底核組織中腺苷含量的影響 同樣，我們采用了Rat Adenosine ELISA Kit檢測了用藥處理后各組大鼠基底核組織中腺苷含量。結果如圖2所示，與對照組大鼠基底核組織中腺苷含量比較，模型組大鼠基底核組織中腺苷含量顯著降低(P<0.01)，阿普唑侖組和SYF高劑量組大鼠基底核組織中腺苷含量顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，阿普唑侖組、SYF高劑量組和SYF低劑量組大鼠基底核組織中腺苷含量均顯著上升(P<0.01)。同阿普唑侖組比較，SYF高劑量組和低劑量組基底核組織中腺苷含量比較，差異均有統計學意義(P<0.01)。SYF高劑量組和SYF低劑量組之間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 各組實驗大鼠基底核中腺苷含量比較

3 討論

目前，各種社會因素造成了失眠人群的不斷增長，長期失眠則會嚴重影響生命質量。長期失眠患者病程較長，易反復發作，難以速愈。臨床缺乏理想的治療失眠的藥物，中醫藥治療失眠目前也取得了很大的進步，療效好，不良反應小的優勢得到了一定的認可[6]。本研究也發現了，中藥復方SYF在改善由失眠引起的癥狀上比西藥阿普唑侖效果好，這也就證實了中醫藥治療失眠的優勢。因此，研究中醫藥防治失眠，揭示其藥理作用機制具有一定的科學意義。

近幾年來，越來越多的實驗證實基底核(Basal Ganglia，BG)在睡眠與覺醒的轉換中起著重要的作用。基底核由紋狀體、蒼白球、丘腦底核和黑質4個主要的核團組成，它們在睡眠與覺醒的調節中又各自起著不同的作用。腺苷A1受體或A2A受體分別與多巴胺D1受體或D2受體在基底核中呈現高表達[7]。多巴胺是腦內含量最多的對維持覺醒起著重要調節作用的興奮性神經遞質[8]。DA能神經元與睡眠、覺醒腦區間存在廣泛的纖維聯系，提示DA系統可能參與了睡眠——覺醒的調控[9]。動物實驗表明，破壞中腦黑質的DA系統后，動物在行為上不能表現為覺醒，但在腦電圖上呈現出明顯的覺醒狀態的快波。精神運動興奮藥如哌醋甲酯，可引起覺醒延長并產生強烈的代償性睡眠反彈[10]。腺苷是研究發現的最強的內源性促睡眠物質之一，腺苷及其受體作為鎮靜催眠的新靶點具有誘人的前景。腺苷水平變化與睡眠呈顯著地正相關，與代謝產物穩態平衡調節睡眠的理論一致。在睡眠剝奪時腦內腺苷水平下降，睡眠恢復時腺苷水平增高[11]。

本研究發現，同對照組比較，失眠模型組大鼠基底核組織中的興奮性神經遞質DA含量顯著的增加。給予模型大鼠中藥復方SYF治療能夠顯著性的抑制DA的釋放作用，使DA恢復到正常水平。同對照組比較，失眠模型組大鼠基底核組織中的抑制性神經遞質腺苷含量顯著的降低，給予模型大鼠中藥復方SYF治療能夠顯著性的增加腺苷的釋放作用，使腺苷恢復到正常水平。以上實驗結果部分證實了，中藥復方SYF在改善由失眠引起的癥狀方面效果是優于西藥阿普唑侖的。睡眠剝奪可以造成的失眠模型大鼠基底核組織中神經遞質DA和腺苷的調節失控。給予中藥復方SYF治療后，失眠大鼠基底核組織中神經遞質DA和腺苷含量回歸到正常水平，表明了疏肝安神法防治失眠的作用機制可能與調控基底核中DA和腺苷釋放途徑相關。

綜上所述，疏肝安神的中藥復方松郁安神方能夠通過調節基底核中DA和腺苷釋放，達到治療失眠的目的。關于疏肝安神類中藥如何調控基底核中DA和腺苷釋放防治失眠的機制還需要更深入的研究去證實。