川芎嗪對大鼠腦缺血再灌注損傷后氧化應激、Ca2+-ATP酶活性及炎癥因子的影響*

葛 亮，曹慧玲，張 潔，徐 敏，朱小飛，陳云峰

南京中醫藥大學附屬醫院檢驗科，江蘇南京 210029

當前，缺血性腦卒中占腦血管病的80%左右，主要因為腦血管局部動脈粥樣硬化、血栓脫落及血管損傷等導致腦供血動脈栓塞，從而引起相應腦組織缺血、壞死，臨床上通過溶栓、使用抗凝藥物等改善腦血液循環，但由于其存在出血的風險和治療時間窗的狹窄性，使得絕大多數患者無法得到有效救治，且血管再通導致腦組織缺血再灌注，并通過誘發氧自由基連鎖反應進一步加重腦組織損傷[1]。川芎嗪是從中藥傘形科植物川芎的根莖中提取的一種生物堿，有效成分為2,3,5,6-四甲基吡嗪，具有活血、化瘀、理氣的功能，以及擴張血管、改善微循環、抗氧化、拮抗鈣離子及抗纖維化等作用，廣泛應用于腦缺血疾病的治療[2]。本研究探討川芎嗪通過改善腦組織氧化應激損傷、提高鈣離子腺苷三磷酸酶(Ca2+-ATP酶)活性及抑制炎癥因子等作用治療腦缺血再灌注損傷，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 SD大鼠，雄性，250～300 g，由上海捷思杰實驗動物有限公司提供，川芎嗪由美國Sigma公司提供。

1.2儀器與試劑 美國ABI公司提供熒光定量PCR儀；美國MD Spectramac M3公司提供多功能酶標儀。2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染液，批號為C428BA0042，由上海生工生物工程有限公司提供；一氧化氮(NO)、超微量Ca2+-ATP酶、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，型號分別為A012-3、A070-4、A003-1、A001-3；cDNA合成試劑盒和One Step TB GreenTMPrimeScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ均由日本TaKaRa提供。

1.3方法

1.3.1實驗動物分組 實驗動物共分為3組，每組10只。假手術組：插入線栓但不阻塞大腦中動脈；模型組：線栓法造模，給予磷酸鹽緩沖液(PBS)；川芎嗪組：線栓法造模，造模24 h后，腹腔注射川芎嗪，劑量50 mg/kg，每天注射1次，連續6 d。

1.3.2線栓法建立腦缺血再灌注模型 采用線栓法致大腦中動脈栓塞(MCAO)建立腦缺血再灌注模型。動物用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥位固定，頸正中線切口，沿胸鎖乳突肌內緣分離肌肉，分離左側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)，在CCA遠心端和近心端及ECA處用動脈夾夾閉，然后近心端結扎CCA、ECA。然后在距CCA分叉部4 mm處剪一小口，將栓線插入到ICA，這時用CCA遠心端的細線輕輕系牢栓線。從血管分叉處開始算，當插入深度在18 mm時，緊緊系牢CCA遠心端的細線，動作輕柔，不要使ICA有任何的牽拉，否則會使栓線脫出CCA。血管外栓線不要留得過長，更不要縫在皮外，大鼠會自行拔出。縫合傷口，單籠飼養觀察。缺血后2 h小心抽出栓線，形成再灌注模型，并于造模第7天處死大鼠，進行后續實驗。

1.3.3神經功能評分 分別于造模第1、3、7 天對各組大鼠進行改良神經功能損傷嚴重程度評分(mNSS)，各項神經功能實驗分值之和作為該組大鼠mNSS行為學評分，分值越高，損傷越嚴重[3]。

1.3.4TTC染色 用0.2 mmoL PBS配制成2%TTC溶液，避光保存，大鼠麻醉后，快速取腦，將腦組織在0 ℃的生理鹽水中冰凍5 min后，由腦前極與視交叉連線中點向后沿冠狀面每隔2 mm切片，切成5片，切片置于2%TTC溶液中，37 ℃避光孵育30 min，不時翻動腦組織切片，使其均勻接觸到染液。

1.3.5大鼠腦梗死率計算 應用image proplus軟件對梗死灶腦組織區域的光密度進行分析，記錄光密度值并計算梗死率。

1.3.6各項指標檢測 Ca2+-ATP酶活性、NO、MDA及SOD水平測定采用化學比色法測定，腦組織炎癥因子[腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-1、IL-6及IL-10] 采用PCR法測定，具體操作方法參照試劑盒說明書。炎癥因子基因相對表達水平采用mRNA 2-ΔΔCT表示。

2 結 果

2.1各組神經功能評分比較 各組大鼠造模前mNSS行為學評分均為0分，神經功能正常，造模后出現神經癥狀，如不能完全伸展對側前爪，行走時向對側傾倒，損傷嚴重者不能行走，參照評分標準，造模第1天模型組和川芎嗪組mNSS行為學評分(分別15.0分、13.5分)與造模前比較，分數均明顯增加，但差異無統計學意義(P>0.05)；造模第3天川芎嗪組mNSS行為學評分(9.5分)與模型組(13.0分)比較，差異有統計學意義(P<0.05)；造模第7 天川芎嗪組mNSS行為學評分(5.5分)與模型組(10.0分)比較，分數明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2TTC染色結果 經TTC染色后，各組大鼠腦組織被染成紅色，梗死區域為白色。假手術組大鼠腦組織為紅色，結構對稱性好；模型組鼠腦組織左側皮質及紋狀體出現白色梗死區域；川芎嗪組梗死區域有所緩解，但仍可見白色梗死灶。見圖1。

注：A為假手術組；B為模型組；C為川芎嗪組。

2.3各組大鼠腦組織梗死率比較 與TTC染色結果一致，與模型組比較，川芎嗪組梗死率明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠腦組織梗死率比較

2.4川芎嗪對大鼠腦組織氧化應激指標NO、MDA及SOD水平的影響 造模第7天，模型組腦組織NO和MDA水平[分別為(4.11±0.05)μmol/gprot、(5.58±0.28)nmol/mg]與假手術組[分別為(1.34±0.24)μmol/gprot、(0.89±0.04)nmol/mg]比較明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)；川芎嗪組NO和MDA水平[分別為(2.55±0.11)μmol/gprot、(3.19±0.22)nmol/mg]較模型組明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)；川芎嗪組SOD活水平[(73.52±3.84)U/mgprot]與模型組[(46.90±4.37)U/mgprot]比較明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.5川芎嗪對大鼠腦組織Ca2+-ATP酶活性的影響 造模第7天，模型組大鼠腦組織Ca2+-ATP酶活性[(0.63±0.01)μmolpi/(mgprot·h)]與假手術組[(1.42±0.07)μmolpi/(mgprot·h)]比較明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，Ca2+-ATP酶活性降低可減弱細胞Ca2+外排，導致細胞鈣超載，川芎嗪組Ca2+-ATP酶活性較模型組升高 [(1.46±0.10) μmolpi/(mgprot·h)]，改善細胞內鈣超載狀況。

2.6川芎嗪對大鼠腦組織炎癥因子的影響 造模第7天，模型組各項炎癥因子基因相對表達水平與假手術組比較均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；川芎嗪組TNF-α、IL-1、IL-6及IL-10基因相對表達水平與模型組比較均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 造模第7天川芎嗪對大鼠腦組織炎癥因子的影響

3 討 論

缺血性腦卒中是一種由多種機制參與的復雜的病理過程，缺氧導致的氧自由基的生成，細胞Ca2+調節失衡，進而炎性反應的激活等環節最終導致神經細胞的壞死或凋亡。臨床上缺血性腦卒中首選治療方案為采用藥物或介入等方法進行溶栓，盡快恢復缺血區的血液供應，減少缺血面積，挽救半暗帶神經細胞，最大限度減輕對腦組織結構和功能的損傷。然而事實上溶栓治療易繼發再灌注損傷誘發氧自由基反應進而破壞血腦屏障的完整性，引起血管性腦水腫，促進炎癥細胞浸潤，造成更為嚴重的病理性損傷[4]。

近年來，川芎嗪及其衍生物作為中醫治療缺血性腦血管病的常用藥物，具有抗氧化、抗凋亡等功效，有研究表明川芎嗪可通過JNK/MARK信號通路抑制缺血再灌注損傷導致的神經細胞凋亡[2]；川芎嗪還可以通過升高SOD水平及降低MDA水平保護神經細胞[5]；其衍生物川芎嗪硝酮易通過血腦屏障，減輕大鼠腦缺血后的腦梗死，保護和/或恢復神經功能，促進神經發生和少突膠質生成[6]。本文也證實，川芎嗪可有效緩解大鼠MCAO模型神經功能損傷狀態，減少梗死腦組織的體積，降低梗死率。然而，目前對川芎嗪治療機制的研究仍不全面，因此，本研究從氧自由基、Ca2+-ATP酶及炎性反應等多個方面進一步研究川芎嗪改善腦缺血再灌注損傷的作用機制，為川芎嗪的臨床治療提供實驗依據。

缺血再灌注損傷導致腦組織產生大量的氧自由基，其中NO是研究的熱點，缺血再灌注過程中NO水平呈現先升高后下降再升高的過程，內皮細胞型NOS(eNOS)產生的NO在缺血早期具有保護神經作用，但作用甚小，神經元型NOS(nNOS)和誘導型NOS(iNOS)產生的NO對神經組織有損傷，前者作用甚微，在病理狀態下，后者大量增加，產生過量的NO，進而發揮神經毒作用，TARKOWSKI等[7]探討了急性腦卒中患者NO及其主要代謝產物與腦損傷的關系，發現缺血早期NO具有一定保護作用，然而晚期NO具有明顯的神經毒性作用，導致嚴重的神經功能缺損。MDA是脂質氧化的最終產物，其水平變化可間接反映組織中氧自由基的變化，SOD作為主要的清除氧自由基的酶，對抗氧自由基對細胞損傷有重要作用[8-9]。本研究中大鼠在造模后，氧化應激指標NO和MDA水平明顯升高，SOD水平明顯降低，說明造模引起的缺血再灌注損傷激活了腦組織的氧自由基，氧化與抗氧化平衡破壞，川芎嗪治療后氧化指標顯著下降，抗氧化指標明顯提高，提示川芎嗪可有效調節損傷后腦組織的氧化平衡狀態，進而降低氧自由基帶來的損傷作用，保護神經細胞。

在中樞神經系統中，Ca2+參與神經細胞興奮、神經遞質釋放等重要功能。鈣超載被認為是各種有害因素導致神經元變性的最后共同通道，可通過激活氧化應激反應、損傷線粒體等途徑引起神經細胞死亡。正常神經細胞內Ca2+與細胞外相近，主要通過電壓依賴型鈣通道、Ca2+-ATP酶等維持Ca2+梯度。缺血時，細胞能量代謝發生障礙，導致細胞膜Ca2+-ATP酶活性下降，細胞Ca2+內流增加，外排減少，從而引起鈣超載[10]。本研究中川芎嗪可保護線粒體，提高Ca2+-ATP酶活性，促進Ca2+排出，降低鈣超載狀態，保護神經組織。

缺血再灌注損傷發生后，大量白細胞浸潤腦組織，產生炎癥因子進而加重了腦損傷，已有大量實驗證明IL-1、IL-6、IL-8及TNF-α等細胞因子參與炎性反應[11]，但有關川芎嗪對炎癥因子調節的報道較少見。本研究結果表明MCAO模型建立后大鼠腦組織中炎性反應活躍，各類炎癥因子表達明顯增加，繼而造成神經細胞的損傷，川芎嗪各項炎癥因子基因相對表達水平均顯著下降，說明川芎嗪可通過抑制炎癥發生改善腦組織微環境，促進神經細胞恢復，進一步探究臨床川芎嗪治療腦卒中的作用機制。