PDGF-B和PDGFR-β蛋白在狼瘡性腎炎中的表達及臨床意義*

張銘明，張 銳，楊小珂，帥宗文

安徽醫科大學第一附屬醫院風濕免疫科，安徽合肥 230022

系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種與自身免疫介導的免疫性炎性反應為突出表現的彌漫性結締組織疾病，其臨床表現復雜，病程遷延反復，以產生許多自身抗體及大量免疫復合物沉積為特征的自身免疫性疾病[1]。狼瘡性腎炎(LN)是SLE最嚴重的并發癥之一[2]，目前對其診斷的金標準主要是通過腎臟組織活檢病理檢查，尋找一些簡單的、特異性的標志物是其研究的熱點。血小板衍生生長因子(PDGF)-B 是來源于人血小板的一種重要的促血管生成因子,它與其受體結合后，可以通過激活與細胞增殖有關的酶來調節細胞外基質的合成和分解，從而減少癌細胞表面黏附分子，促進腫瘤的生長、侵襲與轉移，在腫瘤發病機制中被廣泛研究[3-4]。有研究表明，PDGF-B和β型血小板衍生生長因子受體(PDGFR-β)蛋白通過多種信號通路介導細胞增殖、分化、炎性細胞浸潤等病理生理過程參與腎纖維化形成[5-6]。本研究旨在進一步探討這些蛋白在LN患者腎臟和外周血中的表達及臨床意義。現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年10月至2019年12月安徽醫科大學第一附屬醫院風濕免疫科住院 SLE患者64例為研究對象，男性7例、女性57例，年齡為19～68 歲，平均(38.8±12.0)歲。SLE患者根據文獻[6]診斷標準分為LN組34例、SLE非LN組30例，LN 的納入標準為至少符合以下3個條件中的1條:(1)24 h 尿蛋白定量(24 h UPQ)≥0.5 g，或連續兩次蛋白尿≥3+；(2)存在紅細胞管型、顆粒管型等各種疾病的管型尿；(3)腎損傷，腎功能異常。排除標準為各種原發性、繼發性腎臟疾病。另選取本院健康體檢中心體檢健康者28例作為對照組，男性6例、女性22例，年齡22～67歲，且無自身免疫性疾病家族史。本研究獲得本院倫理委員會的批準。

1.2儀器與試劑 免疫組織化學染色PDGF-B和PDGFR-β抗體來自于Sinobiologic公司，血清PDGF-B和PDGFR-β酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒來自于eBioscience 公司，抗 C1q 抗體ELISA檢測試劑盒來自于德國Orgentec診斷公司，抗 ds-DNA抗體試劑盒由上海科新生物公司提供。洗板機為深圳雷杜公司RaytoRT3100，酶標儀為奧地利 TECAN 公司TECAN sunrise，生化分析儀為羅氏COBAS C 701全自動分析儀。

1.3標本的采集與檢測 SLE腎臟組織標本來源于腎臟穿刺，免疫組化染色采用二步法，染色步驟按常規操作，腎臟組織切片進行常規脫蠟、水化，3%過氧化氫(H2O2) 室溫孵育 10 min 去除內源性過氧化物酶，分別加入PDGF-B抗體(1∶100)和PDGFR-β抗體(1∶100)，陰性對照采用兔IgG作為一抗，陽性對照采用試劑公司提供的陽性對照片。結果按照試劑說明書指示以細胞核或細胞質出現顆粒狀黃色物質為陽性反應。采用陽性細胞占總細胞的百分率評分和染色強度評分來綜合評判。判定標準:染色強度(無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色和2分，棕褐色為3分)；陽性細胞數<10%為0分，10%～<25%為1分，25%～<75%為2 分，≥75%為3分。染色強度和陽性細胞比例得分之和為最終結果來統計陽性表達率，分數≥3 分為陽性表達；組織染色讀片由兩位病理醫師在雙盲的情況下進行，取平均值。SLE患者及對照組血清標本經3 500 r/min 離心 5 min，分離后-20 ℃保存。PDGF-B和PDGFR-β蛋白及抗 C1q 抗體、抗雙鏈DNA(ds-DNA)抗體按照說明書進行ELISA檢測。補體 C3、C4、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、超敏C反應蛋白(hs-CRP)、24 h UPQ、估算腎小球濾過率(eGFR1)采用羅氏COBAS C 701全自動生化分析儀檢測。

2 結 果

2.1各組腎臟組織中PDGF-B和PDGFR-β蛋白陽性表達率比較 LN組腎臟組織中PDGF-B和PDGFR-β蛋白陽性表達率分別為79.41%和76.47%，明顯高于SLE非LN組(分別為36.67%和33.33%)和對照組(分別為6.66%和0.00%)，差異有統計學意義(P<0.05)；SLE非LN組腎臟組織中PDGF-B和PDGFR-β蛋白陽性表達率明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.2各組外周血中PDGF-B和PDGFR-β蛋白表達水平比較 LN組、SLE非LN組外周血中PDGF-B和PDGFR-β蛋白表達水平與對照組比較,差異有統計學意義(P<0.05)。LN組PDGF-B和PDGFR-β蛋白表達水平與SLE非 LN 組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

注：A和B分別為PDGF-B和PDGFR-β蛋白在對照組腎臟組織中的表達；C和D分別為PDGF-B和PDGFR-β蛋白在SLE非LN組腎臟組織中的表達；E和F分別為PDGF-B和PDGFR-β蛋白在LN組腎臟組織中的表達。

表1 各組外周血中PDGF-B和PDGFR-β蛋白表達水平比較

2.3LN患者PDGF-B和PDGFR-β蛋白表達水平與各臨床指標的相關性分析 LN患者腎臟組織中PDGF-B和PDGFR-β蛋白表達水平與抗 C1q 抗體呈正相關(P<0.05)，與eGFR1呈負相關(P<0.05)，與C3、C4、hs-CRP、Cr、BUN、SLE疾病活動指數(SLEDAI)評分、抗ds-DNA抗體、24 h UPQ無相關性(P>0.05)；外周血中PDGF-B和PDGFR-β蛋白表達水平與SLEDAI評分、抗 ds-DNA抗體、24 h UPQ、抗 C1q 抗體呈正相關(P<0.05)，與補體C3、eGFR1呈負相關(P<0.05)，與C4、hs-CRP、Cr、BUN無相關性(P>0.05)。見表2。

表2 LN患者PDGF-B和PDGFR-β蛋白表達水平與各臨床指標的相關性分析

2.4LN患者腎臟組織和外周血PDGF-B與PDGFR-β蛋白表達水平的相關性分析 LN患者腎臟組織和外周血中PDGF-B與PDGFR-β蛋白表達水平均呈正相關(腎臟組織r=0.663,P<0.001；外周血r=0.547,P=0.001)。

3 討 論

LN是SLE最常見的并發癥之一，其臨床表現復雜，進展迅速，大部分LN患者會進展為終末期腎病，而腎臟纖維化是LN腎臟病變進展至終末期腎病的共同通路[7]。近年來，大量臨床和實驗研究表明，腎小管間質纖維化程度是反映腎功能下降嚴重程度和判斷預后最重要的指標，LN腎損傷程度與有無腎小管間質炎癥、腎臟纖維化密切相關，LN活動性增加可加速其纖維化進程[8]，因此，對LN患者中某些炎癥因子及特異性蛋白表達的研究具有重要臨床意義。

PDGF-B和PDGFR-β蛋白作為間充質細胞的有效促有絲分裂劑在細胞的遷移和增殖過程中具有重要的生物學作用。機體內間充質細胞遷移及細胞外基質的沉積與其過表達密切相關，PDGF-B和PDGFR-β蛋白不僅可以通過介導炎癥因子的釋放在免疫調節中發揮重要作用，而且還是間充質細胞(如成纖維細胞、血管平滑肌細胞、軟骨細胞、成骨細胞、破骨細胞等)遷移和增殖的有效激活劑，參與多種疾病的發生發展。有研究表明[9]，PDGF-B可以通過PDGFR-β蛋白啟動與腎纖維化相關的多條信號通路，其中與致纖維化因子轉化生長因子β1(TGF-β1)的協同作用信號通路在促進腎纖維化的進展中具有重要意義。

本研究發現，PDGF-B和PDGFR-β蛋白在對照組腎臟組織中很少或無表達，在SLE非LN組中表達不高，而在LN組中高表達，在LN患者腎小球、球旁器、腎小管間質中均有表達，尤其在腎系膜細胞,間質成纖維細胞和血管平滑肌細胞表達較高。在LN組外周血PDGF-B和PDGFR-β蛋白表達水平也明顯高于SLE非LN組及對照組，結果表明PDGF-B和PDGFR-β蛋白對LN的發生發展具有重要意義，其表達增多是多種通路共同作用的結果，在炎癥細胞、免疫復合物損傷、治療藥物等作用下，腎間質細胞、上皮細胞、系膜細胞等PDGF-B和PDGFR-β蛋白表達上調，PDGF-B和PDGFR-β蛋白的表達上調既可通過多種通路促進細胞生長、分化及遷移，又可介導細胞炎性反應、生長、分化及增殖等生理過程，導致腎小球硬化和小管間質的纖維化。有研究表明，PDGF mRNA在健康者中表達很低，而在系膜增生性腎小球腎炎中，PDGF mRNA和受體的表達均明顯升高，腎小球的損傷程度和PDGF mRNA陽性細胞數的增多具有明顯相關性，增殖性腎炎PDGFR的過度表達與細胞增殖程度、損傷狀態、疾病活動狀態呈正相關，而PDGF-B的特異性抑制劑可明顯減少腎小球內細胞的增生和炎性細胞的浸潤[5,10]。本研究也發現在LN腎臟組織和外周血中PDGF-B蛋白與其受體PDGFR-β蛋白呈正相關，進一步說明PDGF-B蛋白與其受體PDGFR-β蛋白在LN 腎臟組織細胞增生及纖維化中發揮重要作用。PDGF-B蛋白與其受體之間親和度高，PDGF信號通路的傳導可能通過刺激其受體開始，再通過磷酸化、激酶活化等一系列途徑介導，受體PDGFR-β蛋白的活動狀態與刺激的信號強度及磷酸化的程度具有一定的相關性。

LN腎臟組織的免疫損傷主要由大量自身抗原抗體復合物沉積于腎小球和腎小管間質造成，在臨床檢測指標中，特異性自身抗體及補體 C3、C4、Cr、BUN、hs-CRP、24 h UPQ、eGFR1等與其病情活動性及嚴重程度密切相關[11]，本研究發現，在LN腎臟組織中PDGF-B蛋白與其受體PDGFR-β蛋白僅與eGFR1、抗 C1q 抗體呈正相關，而外周血中其表達水平與SLEDAI評分、抗 ds-DNA抗體、hs-CRP、24 h UPQ、eGFR1、抗 C1q 抗體均呈正相關，可能是由于LN腎臟組織免疫病理的改變與外周血中臨床指標改變有不同步的發展，外周血炎癥指標的發展滯后于腎臟組織病理的發展，eGFR1是腎損傷最直接的評價指標，它的變化趨勢直接體現腎臟的損傷程度，抗 C1q 抗體可以通過促進細胞凋亡、抑制凋亡細胞清除，致使大量蛋白產物在腎臟沉積，腎小球補體 C1q 沉積的強度與免疫球蛋白 IgG 復合物量的多少及沉積部位相關，這可能是導致其與腎臟組織PDGF-B、PDGFR-β蛋白直接相關的原因。本研究也發現LN外周血中PDGF-B、PDGFR-β蛋白與炎癥指標及特異性自身抗體密切相關，說明PDGF-B大量分泌后，PDGF-B 除了自身具有促纖維化功能外，還能夠通過其他通路，誘導炎癥因子釋放及自身抗體的產生，從而加速細胞外基質的聚集和細胞的纖維化進程。在LN患者中誘發炎癥后，DNA片段可能過度激活，通過TLR9/TGF-β1/PDGF-B 通路產生大量的PDGF-B，TGF-β1可以誘導腎纖維化，而PDGF-B可以進一步刺激系膜細胞的增生[9]。

有研究表明[12]，通過阻止PDGF-B激活途徑可以有效改善腎小球腎炎等腎臟疾病和LN。在體外研究中[13],PDGF-B和PDGFR-β siRNAs基因的沉默可以減少系膜細胞增殖和遷移，采用TGF-β1/PDGF-B拮抗劑可以阻止腎纖維化和腎衰竭。對SLE 患者進行免疫抑制劑治療后，其SLEDAI評分明顯降低，伴隨TGF-β1/PDGF-B蛋白表達水平下降,因此，PDGF-B/PDGFR-β 信號通路抑制劑的研究為LN患者腎纖維化的治療提供了新的措施[12,14]。

PDGF-B和PDGFR-β蛋白參與了 SLE 腎損傷的發病機制，對LN的判斷具有重要臨床價值。