MMP伴喘息患兒血清NF-κB、HMGB1表達與炎性細胞因子水平的相關性及其診斷價值*

謝 菲，陳瑞東，趙 潔，徐春艷，岳 彬

滄州市中心醫院:1.兒內一科;2.兒內二科,河北滄州 061000

肺炎支原體肺炎(MMP)是兒童常見的呼吸系統感染性疾病，近年來發病率呈升高趨勢[1]。MMP不僅引起咳嗽、咳痰等癥狀，部分兒童可出現喘息癥狀，嚴重影響兒童健康和生活質量，目前對于MMP伴喘息的發病機制仍未完全明確，相關研究表明，氣道炎性反應和免疫紊亂可能是造成喘息發作的重要基礎[2]。核轉錄因子-κB(NF-κB)參與多種炎癥性疾病的發生與發展，其相關通路的激活在機體抗感染性疾病中發揮重要作用，與機體抗MMP有密切關系[3]。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是近年來新發現的一種炎癥介質，在MMP發生和發展中起到重要作用[4]。NF-κB和HMGB1及其相關炎性因子可能與MMP伴喘息的發生密切相關。本研究分析血清NF-κB、HMGB1表達水平與MMP伴喘息患兒炎性細胞因子的關系及其診斷價值，旨在初步探究NF-κB、HMGB1對MMP伴喘息的可能作用機制及兩者的診斷價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年1月至2019年10月本院收治的MMP患兒90例，納入標準：(1)所有患兒均符合MMP的診斷標準[5]。①患兒發熱，表現為弛張熱或不規則熱，咳嗽重；②雙肺呼吸音粗、干啰音或濕羅音；③胸片可見大葉性肺炎、間質性肺炎、支氣管肺炎或肺門淋巴結腫大；④血MMP-IgG或MMP-IgM≥1∶160。(2)患兒年齡1～8歲，入院時病程<2周。(3)入院前6個月內未服用抗感染及影響免疫功能的藥物。(4)患兒家屬對研究知情同意且簽署知情同意協議。排除標準：(1)有支氣管哮喘、慢性呼吸系統疾病的患兒。(2)患有先天性免疫疾病的患兒。(3)合并其他部位感染和炎癥的患兒。(4)不能完成研究的患兒。根據是否伴有喘息分為MMP伴喘息組38例和MMP不伴喘息組52例。另選取同期健康兒童40例作為健康對照組，納入標準：(1)年齡1～9歲；(2)家屬對研究知情同意，能完成研究。本研究經醫院倫理委員會批準，倫理審批號[(倫審)H20171109]。

1.2研究方法

1.2.1標本采集 所有患兒于入院當日采集外周靜脈血5 mL，健康對照組兒童采集外周靜脈血5 mL，均用兩個試管分裝，靜置后經4 000 r/min離心5 min，離心半徑12 cm，分離血清用于熒光定量PCR和酶聯免疫吸附試驗法檢測。

1.2.2熒光定量PCR檢測NF-κB、HMGB1表達水平 取一試管血清，應用Trizol-氯仿-異丙醇-乙醇法提取血清中總RNA，并按照試劑盒操作步驟逆轉錄合成cDNA，試劑盒購自上海吉凱基因化學技術有限公司。利用Primer 5軟件設計目的基因和內參引物，內參采用3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)，以上引物由上海吉凱基因化學技術有限公司設計完成，引物序列見表1。應用熒光定量PCR檢測各組血清NF-κB、HMGB1表達水平，儀器為瑞士Roche公司生產的Cobas 480熒光定量PCR儀，反應條件：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；60 ℃，35 s，共40個循環，經過40個循環擴增后收集熒光信號，根據目的因子、內參GAPDH的循環閾值(Ct)，使用2-ΔΔCt法計算相對表達量：ΔCt=Ct(目的因子)-Ct(GAPDH)；ΔΔCt=ΔCt-ΔCt(對照樣本)，每個樣本設計3個復孔，取3個復孔的平均值作為相對表達量。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.2.3酶聯免疫吸附試驗法檢測炎性細胞因子水平 取另一試管血清，采用酶聯免疫吸附試驗法測定血清白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平，試劑盒為上海酶聯生物技術有限公司生產，嚴格按照試劑盒操作進行。

2 結 果

2.1各組兒童基線資料比較 90例MMP患兒中，MMP伴喘息組患兒38例，男性21例、女性17例，平均(5.38±2.04)歲，平均病程(5.92±2.12)d；MMP不伴喘息組患兒52例，男性29例、女性23例，平均(5.42±2.11)歲，平均病程(5.34±2.15)d ；健康對照組，男性22例、女性18例，平均(5.32±2.27)歲，各組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)；MMP伴喘息組與MMP不伴喘息組性別、年齡、病程比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

2.2各組血清NF-κB及HMGB1表達水平比較 MMP伴喘息組、MMP不伴喘息組患兒血清NF-κB及HMGB1表達水平高于健康對照組，MMP伴喘息組患兒血清NF-κB及HMGB1表達水平高于MMP不伴喘息組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組血清NF-κB及HMGB1表達水平比較

2.3各組血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平比較 MMP伴喘息組、MMP不伴喘息組患兒血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平高于健康對照組，MMP伴喘息組患兒血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平高于MMP不伴喘息組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平比較

2.4MMP伴喘息患兒血清NF-κB及HMGB1表達水平與血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平的相關性分析 經Pearson相關分析結果顯示，MMP伴喘息患兒血清NF-κB表達水平與血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平呈正相關(P<0.001)，血清HMGB1表達水平與血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平呈正相關(P<0.001)，見表4。

表4 MMP伴喘息患兒血清NF-κB及HMGB1表達水平與血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平的相關性分析

2.5血清NF-κB、HMGB1、IL-1β、IL-6及TNF-α水平對MMP伴喘息患兒診斷的ROC曲線分析 繪制ROC曲線分析血清NF-κB、HMGB1、IL-1β、IL-6及TNF-α對MMP伴喘息的診斷價值，結果顯示血清NF-κB最佳臨界值為4.78，其靈敏度為88.28%，特異度為87.38%，ROC曲線下面積(AUC) 為0.863，95%CI為0.752～0.895；血清HMGB1最佳臨界值為3.67，其靈敏度為84.74%，特異度為80.43%，AUC為0.815，95%CI為0.746～0.895；血清IL-1β最佳臨界值為19.53 ng/mL，其靈敏度為70.24%，特異度為64.55%，AUC為0.685，95%CI為0.621～0.732；血清IL-6最佳臨界值為16.24 ng/mL，其靈敏度為73.47%，特異度為66.89%，AUC為0.703，95%CI為0.637～0.754；血清TNF-α最佳臨界值為42.87 ng/mL，其靈敏度為65.54%，特異度為58.23%，AUC為0.635，95%CI為0.596～0.685，血清NF-κB、HMGB1對MMP伴喘息的診斷價值優于血清IL-1β、IL-6及TNF-α，見圖1。

圖1 血清NF-κB、HMGB1、IL-1β、IL-6及TNF-α水平對MMP伴喘息患兒診斷的ROC曲線分析

3 討 論

MMP是一種好發于學齡前兒童的呼吸系統感染性疾病，近年來發病率居高不下，有報道顯示，在冬春季等高發季節，MMP占兒童下呼吸道感染的30%[6]。與普通肺炎不同，MMP可引起胸腔積液、壞死性肺炎、肺不張等，另外約有25%的MMP患兒可出現血液系統、心血管系統并發癥[7-8]。尤其是部分患兒可發生喘息，嚴重影響患兒的生活質量。目前對于MMP患兒發生喘息的機制仍未完全明確，研究表明其機制可能與以下幾方面有關：(1)肺炎支原體直接造成呼吸道上皮損傷，增加呼吸道的反應性[9]；(2)肺炎支原體細胞膜中含有豐富的脂質相關蛋白，進入體內后促進炎性因子的釋放，引起喘息[10]；(3)肺炎支原體感染后激活體內免疫細胞，導致機體免疫功能失調，誘導IgE產生[11]。

NF-κB是一類可以參與多種炎癥性疾病的發生與發展的蛋白質，主要存在于細胞核內，正常情況下僅少量分泌入血液，當機體發生炎性反應時，可以刺激細胞核合成NF-κB，并釋放入血[12]。有研究表明，NF-κB可以選擇性結合B細胞κ輕鏈增強子，進而調節機體多個信號通路[13]。另外當機體發生炎性反應時，NF-κB可以與TNF受體相關因子1結合，引起機體TNF-α水平升高，NF-κB還可以通過與白細胞表面Toll樣受體結合，導致IL-6、IL-8等炎性細胞因子表達升高，引起級聯反應，促進炎癥的發生[14-16]。HMGB1主要存在于細胞核當中，是一種廣泛分布的非組蛋白[17]，XUE 等[18]發現，HMGB1是一種重要的晚期致炎因子，其生成受多種炎性細胞因子的調控，當HMGB1釋放到細胞外，可激活HMGB1/NF-κB通路，從而引發炎性反應。劉麗芬[19]報道指出，HMGB1、TNF-α、C-反應蛋白在支氣管哮喘急性發作中起重要作用。

本研究采用熒光定量PCR檢測MMP伴喘息、MMP不伴喘息和健康兒童血清中NF-κB及HMGB1表達水平，結果顯示，MMP伴喘息組患兒血清NF-κB及HMGB1表達水平高于MMP不伴喘息組和健康對照組，提示在MMP喘息發生中NF-κB及HMGB1起重要作用。分析原因可能為MMP伴喘息患兒存在呼吸道高反應性、免疫功能失調及呼吸道的慢性炎癥，這部分患兒感染肺炎支原體后，誘發機體產生NF-κB，并調節機體多個信號通路，引起級聯反應，促進炎癥的發生[20]；MMP伴喘息患兒HMGB1也大量釋放到細胞外，引發炎性反應[21]。進一步觀察發現，MMP伴喘息組患兒血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平高于MMP不伴喘息組和健康對照組兒童，提示IL-1β、IL-6及TNF-α促進MMP喘息的發生。IL-1β主要由單核細胞、內皮細胞和成纖維細胞產生，具有誘發機體免疫應答、刺激T細胞活化、促進B細胞分泌抗體的作用[22]。IL-6則具有活化T細胞、刺激細胞因子產生、增強自然殺傷細胞功能的作用[23]。當機體發生免疫功能失調時，可以出現IL-1β、IL-6水平升高。TNF-α是機體重要的炎性細胞因子，適當的TNF-α可以對機體起到保護作用，但當TNF-α產生過多時可以促進炎癥細胞的募集和B淋巴細胞增殖，導致機體免疫應答增強[24]。筆者推測，MMP伴喘息患兒存在免疫功能失調和炎性反應，因此血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平升高。

經Pearson相關分析顯示，MMP伴喘息患兒血清NF-κB與IL-1β、IL-6及TNF-α水平呈正相關，血清HMGB1與IL-1β、IL-6及TNF-α水平呈正相關，說明各指標可能參與了MMP伴喘息的發展過程，與陳敏等[25]報道結果相符，推測當MMP患兒發生喘息后HMGB1可促進機體產生IL-1β、IL-6及TNF-α，進而促進疾病發展。本研究還分析了血清NF-κB及HMGB1對MMP伴喘息患兒的診斷價值，結果顯示血清NF-κB診斷MMP伴喘息的靈敏度為88.28%，特異度為87.38%，血清HMGB1診斷MMP伴喘息的靈敏度為84.74%，特異度為80.43%，血清NF-κB、HMGB1對MMP伴喘息的診斷價值優于血清IL-1β、IL-6及TNF-α，提示對疑似MMP患兒進行血清NF-κB及HMGB1檢測可以為MMP伴喘息的診斷提供輔助依據。

綜上所述，MMP伴喘息患兒血清NF-κB、HMGB1表達水平、IL-1β、IL-6及TNF-α水平異常升高，患兒血清NF-κB、HMGB1與IL-1β、IL-6及TNF-α呈正相關。血清NF-κB、HMGB1的檢測對MMP伴喘息具有較好的診斷價值。由于本研究開展時間尚短，收集的病例樣本量較少，因此未進一步對不同病情程度的患兒進行分組且未對入組患兒進行隨訪，以探究血清NF-κB、HMGB1與病情嚴重程度及預后的關系，后續研究將擴大樣本量并增加隨訪以期獲取更加全面的結論。