HPLC切換波長法測定益腎靈顆粒(無蔗糖)中特女貞苷、淫羊藿苷、補骨脂素和異補骨脂素的含量

方慧祥 崔慶德 呂 晉

云南省曲靖市食品藥品檢驗檢測中心，云南 曲靖 655000

益腎靈顆粒為中國藥典[1]收載品種，由枸杞子、女貞子、附子(制)、芡實(炒)、車前子(炒)、補骨脂(炒)、覆盆子、五味子、桑椹、沙苑子、韭菜子(炒)、淫羊藿、金櫻子十三味中藥材組成。益腎靈顆粒具有溫陽補腎之功效，用于腎氣虧虛、陽氣不足所致的陽痿、早泄、遺精或弱精癥。淫羊藿和補骨脂均為方中君藥，女貞子為方中臣藥，現代藥理研究表明，女貞子有促進生長[2]、增強體質[3]、強心[4]等作用；補骨脂有抗腫瘤[5]、抗骨質疏松[6]、抗氧化[7]等作用；淫羊藿有促進生殖[8]、提高免疫[9]、增加骨密度[10]、抗腫瘤[11]等作用。特女貞苷為女貞子的主要成分，具有調節免疫、抗氧化、抗衰老等作用，補骨脂素和異補骨脂素為補骨脂的主要成分，具有植物雌激素作用；淫羊藿苷為淫羊藿的主要成分，具有滋陰補陽、促進造骨細胞增殖等作用，中國藥典[1]選擇特女貞苷、補骨脂素和異補骨脂素、淫羊藿苷分別作為女貞子、補骨脂、淫羊藿三種藥材的含量測定指標。有文獻[12]報道HPLC法同時測定益腎靈顆粒中補骨脂素、異補骨脂素和淫羊藿苷的含量，但同時測定君藥淫羊藿和補骨脂以及臣藥女貞子中淫羊藿苷、補骨脂素、異補骨脂素和特女貞苷的含量未見報道。本實驗參考中國藥典[1]及相關文獻[12-18]，建立HPLC切換波長法同時測定益腎靈顆粒(無蔗糖)中特女貞苷、補骨脂素、異補骨脂素和淫羊藿苷的含量方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-20AT型高效液相色譜儀(配有LC-20AT型輸液泵，CBM-20A型控制器， SIL-20A型自動進樣器，CTO-10AS vp型柱溫箱，SPD-20A型紫外檢測器，DGU-20A5型脫氣機，LCsolution色譜工作站)(日本島津制作所)，XS105型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 材料 特女貞苷對照品(批號:111926-201605，含量：93.3%)，補骨脂素對照品(批號:110739-201617，含量：99.7%)，異補骨脂素對照品(批號:110738-201614，含量：99.9%)，淫羊藿苷對照品(批號:110737-201516，含量：94.2%)，均購置于中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純(德國默克公司)；水為雙蒸水；其余試劑均為分析純；益腎靈顆粒(無蔗糖)(福建省泉州恒達制藥有限公司，批號: 20150409、20160324、20160913)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：依利特 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫為30 ℃；流動相：甲醇(A) -乙腈(B)-水(C),梯度洗脫(25%A始終保持不變；0～35 min，7% B→19% B,35～50 min，19% B→19% B,50.01～60 min，7% B→7% B)；流速為1.0 mL·min-1； 檢測波長：0～20 min，224 nm(特女貞苷)；20～35 min，246 nm(補骨脂素、異補骨脂素)；35～60 min，270 nm(淫羊藿苷)；進樣量：10 μL。

2.2 樣品制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取特女貞苷、淫羊藿苷、補骨脂素、異補骨脂素對照品22.78 mg、66.75 mg 、12.01 mg、12.64 mg置 50 mL 容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，得混合對照品儲備液(質量濃度: 特女貞苷為0.4251 mg·mL-1，淫羊藿苷為 1.2576 mg·mL-1，補骨脂素為0.239 5 mg·mL-1，異補骨脂素為0.2525 mg·mL-1)，精密量取混合對照品儲備液1 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品使用液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取益腎靈顆粒(無蔗糖)5袋，精密稱定，研細，取約5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，稱定重量，置水浴上回流1 h，放冷，再稱定重量，用60%乙醇補足減少的重量，搖勻，靜置，取上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按處方比例及工藝，分別制得缺女貞子、缺補骨脂、缺淫羊藿的陰性對照，按“2.2.2”項下方法制成陰性對照溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 分別精密量取“2.2.1”項下的混合對照品儲備液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL, 分別置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得。分別進樣10 μL，記錄峰面積。以進樣量(x,μg)為橫坐標,峰面積(y)為縱坐標,進行線性回歸,分別得特女貞苷、補骨脂素、異補骨脂素和淫羊藿苷回歸方程為y=1268121.8x+250.4，r=0.9997(n=7);y=7680626.9x+1180.9，r=0.9999(n=7);y=7581018.9x+4347.4，r=0.9999(n=7);和y=2297168.2x+1699.7，r=1.0000(n=7)。結果表明，特女貞苷、補骨脂素、異補骨脂素和淫羊藿苷的進樣量分別在0.03401～0.8501 μg、0.01916～0.4790 μg、0.02020～0.5051 μg、和0.1006～2.5151 μg的范圍內與其峰面積積分值呈良好的線性關系。混合對照品、供試品及陰性對照的色譜圖如圖1所示。

2.3.2 精密度試驗 精密吸取“2.2.2”項下經0.45 μm的微孔濾膜濾過的供試品溶液10 μL，連續進樣6次，記錄峰面積。結果，特女貞苷、補骨脂素、異補骨脂素和淫羊藿苷峰面積的RSD分別為0.74%、0.56%、0.58%和0.43%。表明儀器精密度良好。

2.3.3 空白試驗 吸取“2.2.3”項下的陰性對照溶液，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，結果顯示，陰性對照在與對照品和供試品色譜峰保留時間相應位置上，沒有相應的色譜峰，表明陰性對照不干擾測定。

2.3.4 重復性試驗 取同一批樣品(批號：20160324)6份，按“2.2.2”項下制備，測定特女貞苷、補骨脂素、異補骨脂素和淫羊藿苷的含量，其含量的RSD分別為0.75%、0.86%、0.79%和0.60%，表明方法重復性良好。

2.3.5 穩定性試驗 取“2.2.2”項下制備好的同一份樣品，分別在0、2、4、8、16、24、36 h進樣10 μL，記錄峰面積。結果，特女貞苷、補骨脂素、異補骨脂素和淫羊藿苷峰面積的RSD分別為0.96%、0.69%、0.73%和0.55%，表明樣品在36 h內穩定。

2.3.6 加樣回收率試驗 取已知含量的益腎靈顆粒(無蔗糖)(批號：20160324)6份，每份約3 g，精密稱定，精密加入“2.2.1”項下的混合對照品儲備液1 mL，再精密加入60%乙醇49 mL，按“2.2.2”項下操作。測得加樣回收率見表1。

2.3.7 樣品測定結果 分別取3批益腎靈顆粒(無蔗糖)，按“2.2.2”項下的方法操作，測定含量。結果見表2。

表1 加樣回收率試驗結果 (n=6)

續表1

表2 樣品含量測定結果 (mg/g， n=3)

3 討論

3.1 提取方法的選擇 參考中國藥典[1]及相關文獻[12-15]，以提取溶劑(甲醇和乙醇)、提取溶劑濃度(40%、60%、80%、100%)、提取方法(超聲和回流)、提取時間(20 min、40 min、60 min、80 min)為試驗因素進行正交試驗，發現用60%的乙醇回流提取1 h效果最好。從而確定用60%的乙醇回流提取1 h為本試驗的提取方法。

3.2 檢測波長的選擇 分別取特女貞苷、補骨脂素、異補骨脂素和淫羊藿苷對照品溶液在200～500 nm范圍內進行紫外掃描，特女貞苷、補骨脂素、異補骨脂素和淫羊藿苷分別在224 nm、246 nm、246 nm和270 nm處有最大吸收。為簡化方法，參考中國藥典[1]及文獻[12-13,17-18]使用的檢測波長，進行單波長同時檢測以上四個成分，當用224 nm波長時，補骨脂素、異補骨脂素和淫羊藿苷響應值偏低，當用246 nm時，特女貞苷和淫羊藿苷響應值偏低，當用270 nm時，特女貞苷、補骨脂素和異補骨脂素響應值偏低，不利于定量測定，故最終定為切換波長法進行測定。

3.3 流動相的選擇 曾嘗試用甲醇-水系統或乙腈-水系統進行分離，當采用甲醇-水系統時異補骨脂素的保留時間與淫羊藿苷的保留時間相差太遠，浪費分析時間，當采用乙腈-水系統時異補骨脂素的保留時間與淫羊藿苷的保留時間相差太近，不利于切換波長，最后采用甲醇-乙腈-水系統得到良好效果，因此本試實驗最終將流動相甲醇-乙腈-水進行梯度洗脫。

現代醫學研究[19-20]發現，益腎靈顆粒對改善少、弱精男性的精液質量有較好的臨床療效。益腎靈顆粒中淫羊藿為補腎壯陽之要藥，具有補腎陽的功效，補骨脂具有溫腎助陽的功效，女貞子具有滋補肝腎的功效。中成藥的臨床療效是來自組方中各味中藥的綜合作用，為保證臨床療效，同時控制多味中藥質量顯得尤為重要。本方法能同時測定益腎靈顆粒(無蔗糖)中特女貞苷、補骨脂素、異補骨脂素和淫羊藿苷的含量，對保證益腎靈顆粒臨床療效發揮積極作用。