豬源腸外致病性大腸桿菌致腦膜炎機(jī)制的研究進(jìn)展

楊曉培，倪楊帆，趙 靜，萬 云，黎 巧，肖 冉，岳 龍，黃 微，袁曉丹，楊 洋，謝文浩，阮 征

（1.武漢市動物疫病預(yù)防控制中心，武漢 430070；2.武漢農(nóng)業(yè)檢測中心，武漢 430014）

細(xì)菌性腦膜炎是一種嚴(yán)重危及生命的疾病，它是由于細(xì)菌感染導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其發(fā)病率和死亡率較高。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)不斷進(jìn)步，診斷技術(shù)和針對性的抗生素治療手段不斷完善，細(xì)菌性腦膜炎的診療情況有所進(jìn)展，但由于其難以確診、病程發(fā)展迅速、缺少有效的疫苗預(yù)防等特點(diǎn)，仍嚴(yán)重威脅著人類的生產(chǎn)和生活。在我國，腸外致病性大腸桿菌（ExPEC）作為一種人畜共患病細(xì)菌，菌群耐藥情況復(fù)雜，大多數(shù)細(xì)菌性腦膜炎病例由血源性擴(kuò)散引起，當(dāng)循環(huán)的細(xì)菌穿透血腦屏障（BBB）時(shí)，將破壞腦實(shí)質(zhì)并最終引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，近一半的幸存者患有不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)疾病（如智力遲鈍、聽力障礙和失明）。數(shù)據(jù)顯示，在不同地域和不同年齡段，ExPEC 導(dǎo)致的細(xì)菌性腦膜炎病例占全部病例的50%；在3 歲以下的兒童群體中，該病的死亡率達(dá)21%，10%～20%的幸存患者會出現(xiàn)認(rèn)知障礙、雙側(cè)聽力喪失、運(yùn)動障礙、癲癇、視力受損和腦積水等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥［1，2］。

1 豬源腸外致病性大腸桿菌的研究

目前，大腸桿菌致腦膜炎主要以K1莢膜菌株為研究對象［3］。研究發(fā)現(xiàn)，感染PCN033 菌株的小鼠腦組織的病理切片顯示出明顯的腦膜炎病變［4］。PCN033菌株屬于臨床分離的豬源ExPEC，是1種K2莢膜菌株，現(xiàn)對其在細(xì)菌性腦膜炎機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行探討。

ExPEC 與毒力相關(guān)的因子包括脂多糖（LPS）、莢膜、菌毛、鞭毛、生物被膜、分泌系統(tǒng)、鐵離子攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)等，這些毒力因子在引起細(xì)菌性腦膜炎的過程中起到重要作用。LPS 作為革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜的主要成分，可在宿主體內(nèi)誘發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。Bao 等［5］發(fā)現(xiàn)，在引起腦膜炎的過程中，LPS 能夠結(jié)合機(jī)體產(chǎn)生的溶菌酶，降低溶菌酶活性，從而減弱溶菌酶對細(xì)菌的殺傷作用。莢膜是細(xì)菌的表面抗原，耐干燥、促進(jìn)細(xì)菌與細(xì)胞表面、細(xì)菌之間的黏附、抵抗宿主免疫系統(tǒng)。Kim［3］發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌表面K1 莢膜能夠抑制溶菌酶與內(nèi)吞小泡結(jié)合，有利于細(xì)菌存活、繁殖，最終跨越BBB 進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。菌毛、鞭毛菌有黏附細(xì)胞的功能，且鞭毛與生物被膜的形成有關(guān)。Liu 等［6］在研究鞭毛系統(tǒng)對hBMEC粘附作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lag-1 系統(tǒng)在鞭毛結(jié)構(gòu)的合成和成熟中起到重要作用，編碼鞭毛鉤支架蛋白的flgD基因是介導(dǎo)細(xì)菌游動和群集的重要蛋白，flgD缺失可減弱ExPEC菌株在體內(nèi)的侵襲和定殖。

2 豬源腸外致病性大腸桿菌感染hBMECs組學(xué)研究

BBB 主體結(jié)構(gòu)由單層hBMECs 有秩序的排列形成致密層，這種致密的結(jié)構(gòu)可以將腦和血管內(nèi)的空間隔離開來，同時(shí)細(xì)胞頂部和細(xì)胞基底外側(cè)的表面蛋白發(fā)生極化。Liu 等［7］、Yang 等［8］通過將PCN033與hBMECs 互作后收集細(xì)胞，分別提取hBMECs 蛋白和RNA，比較感染前后hBMECs 蛋白和RNA 的變化，尋找豬腸外致病性大腸桿菌致人腦膜炎關(guān)鍵分子。

2.1 蛋白組學(xué)研究

Liu等［7］通過比較感染前后蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)，主要有2 大類蛋白的表達(dá)發(fā)生了改變，他們分別參與了PCN033 誘導(dǎo)的緊密連接損壞和神經(jīng)炎癥反應(yīng)。巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（MIF）促進(jìn)了腦膜炎大腸桿菌誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，并通過降低ZO-1、occludin 等緊密連接蛋白，有助于破壞血腦屏障；同時(shí)發(fā)現(xiàn)NF-κB 和MAPK 信號通路在hBMECs對腦膜炎大腸桿菌的響應(yīng)中起主導(dǎo)作用，主要包括IL-6、IL-8、TNF-α 和IL-1β 在內(nèi)的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

2.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

近年來，長鏈非編碼RNA（lncRNA）和環(huán)狀RNA（CircRNA）的研究主要集中在腫瘤方面，他們在細(xì)菌性腦膜炎中的調(diào)節(jié)作用還尚不明確。通過RNA測序，Yang 等［8］發(fā)現(xiàn)PCN033 感染hBMECs 中有25 257 個(gè)lncRNA 發(fā) 生改 變，包括24 645 個(gè) 已注 釋和612 個(gè)新發(fā)現(xiàn)的；共有895 個(gè)lncRNA 表現(xiàn)出顯著差異，其中有382個(gè)上調(diào)，513個(gè)下調(diào)，通過生物信息學(xué)分析，預(yù)測了lncRNA 的特征以及l(fā)ncRNA 與mRNA之間潛在的調(diào)控關(guān)系。Yang 等［9］通過組學(xué)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)細(xì)菌性腦膜炎相關(guān)RNA，進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)了hsa-miR-93-5p 與血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）之間的負(fù)調(diào)控關(guān)系，hsa_circ_2858 可以競爭結(jié)合hsamiR-93-5p；hsa_circ_2858 過表達(dá)之后，VEGFA 表達(dá)顯著上調(diào)，但同時(shí)對hsa-miR-93-5p 進(jìn)行過表達(dá)后，hsa_circ_2858對于VEGFA 的上調(diào)作用受到了完全的抑制［9］。

Yang 等［10］在PCN033 感染星形膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析中發(fā)現(xiàn)，有2 045 個(gè)mRNA、74 個(gè)lncRNA、27 個(gè)miRNA 和418 個(gè)circRNA 被差異表達(dá)。星形膠質(zhì)細(xì)胞中mRNA 顯著上調(diào)主要與TNF、HIF-1、NF-κB、MAPK 等炎癥信號通路及凋亡有關(guān)；mRNA 靶向上調(diào)的lncRNA 主要富集于ErbB 和mTOR 信號通路，下調(diào)的lncRNA 靶點(diǎn)與運(yùn)輸和代謝途徑相關(guān)，包括囊泡運(yùn)輸中的SNARE 相互作用、唾液分泌、組氨酸代謝及β-丙氨酸代謝。

3 BBB模型的構(gòu)建及研究

BBB 是細(xì)菌感染腦膜炎前的最后一道屏障，它主要由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和周皮細(xì)胞構(gòu)成。hBMECs 通過表面的緊密連接蛋白組成了BBB 的主體結(jié)構(gòu)。小膠質(zhì)細(xì)胞在外與周皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞共同構(gòu)成BBB的免疫細(xì)胞群。

3.1 緊密連接蛋白

通過對PCN033 感染小鼠和hBMECs 的體內(nèi)體外研究發(fā)現(xiàn)，ExPEC 感染鋅指轉(zhuǎn)錄抑制因子（Snail-1）缺失的hBMECs，細(xì)胞表面緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5、β-catenin 均發(fā)生顯著下調(diào)，表明Snail-1調(diào)控了上述蛋白的表達(dá)［11］。

3.2 細(xì)胞骨架蛋白

肌動蛋白絲是由雙鏈蛋白集合而成的高度組織化的結(jié)構(gòu)單元，包括肌動蛋白束、肌動蛋白網(wǎng)狀物、皮質(zhì)肌動蛋白微絲和膜表面的細(xì)胞骨架蛋白，這些結(jié)構(gòu)通過微管、微絲和中間絲纖維結(jié)合形成細(xì)胞骨架。研究發(fā)現(xiàn)hBMECs感染PCN033后，激活了表皮生長因子受體（EGFR），其相關(guān)配體HB-EGF被激活，活化的EGFR 與ErbB3 形成二聚體，競爭性地從細(xì)胞內(nèi)的F -actin 招募和分解ACTN4，導(dǎo)致宿主細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架重排，最終促使細(xì)菌入侵［12］。

3.3 通透性

目前檢測細(xì)菌突破BBB 的方法主要包括細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型［13］、腦部載菌量檢測［11］和染料滲透性檢測［11］3 種方法，通過相互驗(yàn)證判斷細(xì)菌感染是否突破BBB。

4 PCN033致細(xì)菌性腦膜炎免疫機(jī)制研究

PCN033 成功穿透BBB 在體內(nèi)形成菌血癥，完成對hBMECs的侵襲，在此過程中PCN033通過細(xì)胞穿透血屏障而不改變hBMECs 單層的完整性，通過特定的宿主細(xì)胞因子和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)腦膜炎的發(fā)生，其潛在機(jī)制仍不明晰［14］。

研究發(fā)現(xiàn)，PCN033 感染hBMECs 后，hBMECs 表面多個(gè)重要蛋白、lncRNA 的表達(dá)發(fā)生了改變，細(xì)胞內(nèi)信號通路被激活，從而介導(dǎo)神經(jīng)炎癥的發(fā)生。PCN033 感染hBMECs 后，誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮血管生成素樣4（ANGPTL4）高表達(dá)，通過激活A(yù)RHGAP5/RhoA/MYL5信號通路，增加MYL5的表達(dá)，破壞BBB功能［13］；Yang 等［11］發(fā)現(xiàn)，PCN033 感染誘導(dǎo)VEGFA和Snail-1 的上調(diào)，并由此激活TLR2-MAPK-ERK1/2 信號通路，感染反應(yīng)中促炎細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生也促進(jìn)了VEGFA 和Snail-1 的上調(diào)，從而進(jìn)一步介導(dǎo)了BBB 的破壞；Yang 等［15］發(fā)現(xiàn)ICAM-1 的上調(diào)有助于中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞募集，以及腦膜炎大腸桿菌感染后的神經(jīng)炎癥破壞；Amjad 等［16］發(fā)現(xiàn)，PCN033 感 染hBMECs 后，miR-19b-3p 顯著下調(diào)，從而通過增加NF-κB 信號的負(fù)調(diào)控因子TNFAIP3 的表達(dá)來降低促炎細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生。

5 小結(jié)

目前，PCN033 的致病機(jī)制在研究中不斷被發(fā)掘，研究主要集中在細(xì)菌的毒力因子的作用和相互作用的細(xì)胞表面蛋白和重要轉(zhuǎn)錄因子。近年來，關(guān)于ncRNAs 的功能報(bào)道也逐漸增多，其在病原菌致病的各個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮著直接或者間接的調(diào)控作用；進(jìn)一步探究ExPEC 感染過程中circRNAs 的調(diào)控機(jī)制，也有助于加深對CNS 感染性疾病的理解。了解Ex-PEC 與宿主相互作用機(jī)制，也有助于預(yù)防和治療由ExPEC導(dǎo)致的腦膜炎。