豬場偽狂犬病毒變異與凈化

宋國盛，朱利俊，張錦國，郭少春

（1.湖北省武穴市動物衛生監督局，湖北 武穴 435400；2.湖北省武穴市動物疫病預防控制中心，湖北 武穴 435400；3.湖北省武穴市畜牧技術推廣站，湖北 武穴 435400；4.湖北省武穴市大金鎮畜牧獸醫技術服務中心，湖北 武穴 435400)

豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的豬繁殖障礙性疫病，可造成新生仔豬發熱、腹瀉、嘔吐及神經癥狀，死亡率極高[1]。豬偽狂犬病的凈化已被列入國家中長期動物疫病防治規劃，標記疫苗免疫及鑒別野毒診斷是目前凈化該病的主要手段。本試驗調查了不同毒株的標記疫苗在不同豬群中的免疫效果、不同豬群的野毒感染情況及凈化效果，以期為偽狂犬病的凈化提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

偽狂犬病毒gB 抗體檢測試劑盒（gB-ELISA）、偽狂犬病毒gE 抗體檢測試劑盒（gE-ELISA）、偽狂犬病毒PCR 抗原檢測試劑盒，武漢科前生物股份有限公司；酶標檢測儀，美國BIO-RAP 公司；實時熒光定量PCR 設備，西安天隆科技有限公司；豬偽狂犬病毒弱毒疫苗（變異株）、豬偽狂犬病毒滅活疫苗（變異株），武漢科前生物股份有限公司；豬偽狂犬病毒弱毒（Bartha-K61 株）疫苗、豬偽狂犬病毒滅活（Bartha-K61株）疫苗，某動物保健品有限公司。

1.2 試驗設計

對襄大（武穴）農牧有限公司豬場的偽狂犬病毒野毒進行普查，確定是否有變異偽狂犬病毒野毒感染。為選擇正確的疫苗種類、免疫時機和免疫劑量，分別進行了下列5個試驗。

1.2.1 試驗1 對618 頭生產母豬、186 頭后備母豬進行gE抗體檢測和PCR抗原檢測，統計檢測結果及2種檢測方法的符合率。

1.2.2 試驗2 對957 頭哺乳仔豬進行不同日齡哺乳仔豬的血清學和病原學普查，統計哺乳仔豬不同日齡的野毒帶毒情況及2種檢測方法的符合率。

1.2.3 試驗3 對1 016 頭斷奶仔豬和育肥豬進行普查，分析變異株野毒感染規律及2 種檢測方法的符合率。

1.2.4 試驗4 隨機抽取100 頭生產母豬，分為2組，分別注射國產疫苗和進口疫苗，生產母豬注射時間為產前35、20 d，后備母豬注射時間為配種前35、20 d，分別注射1 頭份弱毒疫苗和滅活疫苗；檢測疫苗有效抗體的形成時間、達到高峰時間、持續時間、開始衰落時間，對比國產疫苗和進口疫苗免疫后的野毒陽性率。

1.2.5 試驗5 根據試驗4 分組母豬所產后代自動分組，2 組隨機選取478 和479 頭哺乳仔豬，分別于42 日齡和65 日齡各注射1 頭份偽狂犬基因缺失弱毒苗，檢測哺乳仔豬75 日齡的野毒陽性率，進行國產疫苗和進口疫苗的對比試驗。

1.2.6 試驗6 根據試驗5 分組繼續檢測斷奶仔豬不同日齡偽狂犬野毒轉陽率，在免疫后150 d 檢測育肥豬偽狂犬帶毒陽性率以及出欄存活率。

1.3 血清樣品的采集與處理

試驗1-3 中每頭母豬和仔豬無菌采血1 頭份，保留有效血清5 mL,檢測所有血清中偽狂犬野毒gE抗體和PCR 抗原。試驗4每頭母豬和仔豬無菌采血1 頭份，保留有效血清5 mL,并分別于疫苗注射后15、30、60、90、120、150 d 采血，檢測所有血清疫苗gB 抗體和gE 抗體。試驗5 每頭仔豬無菌采血1 頭份，每隔10 d 采血1 次直至75 日齡，每次保留有效血清5 mL。試驗6 仔豬和育肥豬每隔10 d 采血1次，直至免疫后150 d，每次保留有效血清5 mL.

1.4 野毒抗體和疫苗抗體滴度檢測

按1∶2 的比例稀釋待檢血清，每1 個樣品1 個吸嘴，樣品加到酶標孔內之前混合均勻，靜置待檢。參照偽狂犬病gB和gE抗體試劑盒檢測程序進行。

抗體結果判定：①S/N≥0.42 為PRV-gE 抗體陽性。②S/N≤0.38 為陰性。③0.38＜S/N＜0.42 為可疑樣品，需要重復試驗確定最終結果。

1.5 偽狂犬病毒野毒抗原檢測

參照偽狂犬病毒PCR 抗原檢測試劑盒操作規程執行。當標本檢測Ct值≤35 或有明顯指數增長期，判定為陽性；當標本檢測Ct值在35～38，應對標本進行重復檢測，如重復試驗結果Ct值仍在35～38范圍內，有明顯指數增長期，則判定為陽性，否則為陰性。當標本檢測Ct值＞38 或無Ct值，判定為陰性。

2 結果與分析

2.1 生產母豬、后備母豬PRV gE 抗體和PCR 抗原檢測結果

該養殖場一直使用武漢科前生物股份有限公司HB98 偽狂犬基因缺失弱毒疫苗,防控效果較好。試驗前期，生產母豬有類似偽狂犬的臨床癥狀，血清學gE 抗體檢測結果顯示該豬場PRV 感染嚴重,通過PCR 檢測，確認為偽狂犬變異株所引起。從高胎齡生產母豬、青年母豬到后備母豬野毒陽性率呈明顯上升趨勢，說明野毒是按照后備母豬、青年母豬、高胎齡生產母豬的順序感染的。由表1可見，4胎以上母豬PRV 抗原與血清學抗體符合率明顯降低，說明母豬自身在清除病毒。

表1 生產母豬、后備母豬PRV的gE抗體陽性率與PCR陽性率檢測結果

2.2 哺乳仔豬PRV感染gE抗體檢測結果

由表2可知，哺乳仔豬gE抗體陽性率較高，PCR抗原陽性率較低，可能與仔豬母源抗體有關；隨著仔豬日齡的增長，PCR抗原陽性率上升，這可能與母源抗體不斷下降有關。

表2 哺乳仔豬PRV gE抗體陽性率和PCR抗原陽性率檢測結果

2.3 斷奶仔豬和育肥豬PRV 感染gE 抗體檢測結果

由表3可知，仔豬斷奶前期，PCR抗原陽性與gE抗體陽性符合率較低，說明存在部分仔豬假陽性的現象，仔豬在90 日齡左右陽性率明顯上升，說明疫苗選擇和免疫程序還有待改善。

表3 斷奶仔豬和育肥豬PRV gE抗體陽性率和PCR抗原陽性率檢測結果

2.4 國產疫苗和進口疫苗gB和gE抗體檢測結果

2.4.1 國產疫苗和進口疫苗gB 抗體陽性率檢測結果 由表4 可知，國產疫苗和進口疫苗的免疫效果均表現良好，免疫后均可產生較高的抗體水平，表明本試驗母豬的免疫程序合理。

表4 接種疫苗前后不同時間各組母豬PRV gB抗體陽性率 （單位：%）

2.4.2 國產疫苗和進口疫苗gE 抗體檢測結果2 組母豬均為50 頭，免疫前陽性母豬均為12 頭，gE 抗體陽性率為24.00%；國產變異株疫苗和進口經典株疫苗免疫150 d 分別有3 頭、10 頭陽性母豬，gE 抗體陽性率分別為6.00%和20.00%。這表明國產變異株疫苗與野毒同源性高，而進口經典株疫苗同源性低，國產變異株疫苗對野毒阻斷率要優于進口經典株疫苗。

2.5 哺乳仔豬國產疫苗和進口疫苗野毒抗體檢測結果

國產變異株疫苗共免疫哺乳仔豬478 頭，免疫前陽性仔豬為94 頭，gE 抗體陽性率為19.67%；免疫后75日齡陽性仔豬為5頭，gE抗體陽性率為1.05%。進口經典株疫苗共免疫哺乳仔豬479 頭，免疫前陽性仔豬為94 頭，gE 抗體陽性率為19.62%；免疫后75日齡陽性仔豬為14 頭，gE 抗體陽性率為2.92%。哺乳仔豬注射疫苗前后，國產變異株疫苗組和進口經典株疫苗組偽狂犬野毒陽性率沒有明顯差異。

2.6 斷奶仔豬和育肥豬國產疫苗和進口疫苗gE抗體檢測結果

國產變異株疫苗共免疫斷奶仔豬和育肥豬478頭，免疫前陽性數為144 頭，gE 抗體陽性率為30.13%；免疫后150 d 陽性數為39 頭，gE 抗體陽性率為8.16%；出欄472 頭，出欄率為98.74%；進口經典株疫苗共免疫479 頭，免疫前陽性數為143 頭，gE抗體陽性率為29.85%；免疫后150 d陽性數為138頭，gE 抗體陽性率為28.81%；出欄443 頭，出欄率為92.48%。這表明，國產變異株疫苗組和進口經典株疫苗組對斷奶仔豬和育肥豬的野毒感染阻斷率差異明顯，國產變異株疫苗對野毒有良好的阻斷效果。此外，國產變異株疫苗組的出欄數和出欄率也明顯更高。

3 小結與討論

國產變異株疫苗和進口經典株疫苗都為我國規模化豬場豬偽狂犬病防控做出了重要貢獻[2]，均具有抗體上升速度快、抗體滴度高、穩定、保持時間長等優點。但從試驗結果可知國產變異株疫苗相較于進口經典株疫苗對變異毒株的阻斷能力明顯更強。

免疫之前，該豬場母豬出現產死胎、弱仔、流產等癥狀，是病毒急性感染胎盤的臨床表現。但母豬自身抗病毒的能力較強，病毒感染表現為隱性，母豬gE 抗體陽性率呈逐步下降的趨勢。病毒一旦感染母豬，會終身在其神經系統潛伏。從試驗4 結果可知，感染過病毒的母豬經過疫苗強化免疫，雖然能清除血液中的病毒，但不能清除神經系統中病毒。哺乳仔豬出生表現出神經癥狀、腹瀉癥狀，出現高死亡率，這與野毒的毒力有關，如果阻斷病毒通過血液向胎盤傳播，這些臨床癥狀都可以減輕甚至消除。

從斷奶仔豬的檢測結果可知，90 日齡時仔豬抗體水平最低，此時是變異株偽狂犬野毒感染斷奶仔豬的重要時期，隨后育肥豬群病毒載量會不斷增加，育肥豬群會出現嚴重咳嗽、喘氣等臨床癥狀，緊急接種偽狂犬弱毒疫苗可以明顯改善臨床癥狀。因此，在哺乳仔豬65 日齡第2 次接種偽狂犬滅活苗或在90 日齡再接種1 次偽狂犬滅活苗，可以保持育肥豬高抗體水平，從而減少育肥豬感染野毒。控制豬場偽狂犬病的關鍵是要控制育肥豬群病毒載量，90 日齡豬群是野毒感染最開始的階段，育肥豬又是豬場最大的飼養群體，因此豬場要著重解決好育肥豬的問題。

自2011 年開始報道豬偽狂犬變異毒株以來[3]，該病已在世界范圍內流行。襄大（武穴）農牧有限公司養殖場也感染了變異株偽狂犬病毒，試驗開始前，該豬場偽狂犬病毒不穩定，表明國內外生產的基因缺失弱毒疫苗已出現免疫失效，建議使用國產變異株弱毒疫苗并配合使用變異株滅活疫苗，以加強豬群對PRV的免疫。

國產豬偽狂犬變異株疫苗可以明顯降低母豬和育肥豬野毒gE 抗體陽性率，其對變異株野毒的阻斷能力明顯高于進口經典株疫苗。應加強對豬偽狂犬變異株疫苗的研制及免疫程序的研究，以實現變異株豬偽狂犬病可防可控，規模化豬場可以通過消毒、免疫、隔離、捕殺、補充陰性豬群等生物安全措施進行凈化。