侵襲性真菌感染檢測方法的研究進展

范超宇(內蒙古醫科大學附屬醫院，內蒙古 呼和浩特 010000)

0 引言

真菌是環境中常見的一種真核微生物，它常常定居于人類皮膚及黏膜，可以不引起免疫反應，在人類免疫系統功能正常時可與人類共存[1-2]，然而，在免疫功能損傷、人類宿主的屏障被破壞的時候，真菌便可以侵犯人體，引起真菌感染[1]。與其他微生物感染相比，在臨床中對真菌感染的認識較淺、診斷的方法不多、大多數患者不能得到早期診治。在相關統計中，世界上150萬種真菌里有400多種可以引起人類的嚴重感染。侵襲性真菌感染每年導致160萬人死亡，死亡的人數約等于瘧疾和結核[3]。大部分IPFD病人本身有嚴重基礎疾病，并且診斷與治療不及時，導致預后差，IFIs 患者人數持續上升[4]。酵母菌類的真菌感染占90%以上，有念珠菌類Candida spp.、毛孢子菌類Trichosporonspp.、白地霉Geotrichum、隱球菌類Cryptococcus spp.和紅酵母類Rhodotorula spp.等[4]。感染最常見的真菌類型是念珠菌，其死亡率大致為15%-35%，發展中國家甚至有高達40%的死亡率[4-6]；毛孢子菌是導致血液病患者真菌敗血癥最主要的真菌，感染死亡率高達60%至80%[7]；紅酵母常導致導管相關感染，死亡率約9.1%[8]；白地霉類真菌感染常由重度免疫功能損傷所致[9]。肺真菌感染相關研究顯示，在非惡性血液疾病患者中，排名靠前的肺真菌病依次為肺曲霉感染(37.9%)，肺念珠菌感染(34.2%)，肺隱球菌感染(15.6%)，肺孢子菌感染。感染曲霉病的病死率可高達80%以上[10-11]。

近些年由于自然、社會環境不斷地發生變化，主要致病真菌病原譜在不斷地改變。除了常見的真菌感染，許多之前沒有致病性的環境真菌發生了進化、變異，成為了致病真菌，甚至成為了多重耐藥的強致病菌。耳念珠菌Candida auris就是近年來的超級真菌，國際傳染病領域對其廣泛關注。它對大多常用抗真菌藥物耐藥，且確診困難，在醫院相關場所存活時間長，傳播范圍廣，可引起暴發式感染，使其成為世界范圍內診斷與治療的難點，它的致死率高于50%[12]。此真菌從2009年至今已傳播至18個國家[13-14]，侵襲性真菌感染的早期鑒別與診斷尤為重要，對患者預后有著重要的影響，現今診斷技術及其未來發展都是值得關注的。

1 傳統的檢查方法較局限

組織病理學檢查及微生物培養是真菌感染疾病的傳統與直接的檢測方法。但是有下列缺點：(1)如果獲取的標本來自非無菌部位，則不能區分真菌污染、定植和感染，不能將其作為確診的依據；如果以侵入性檢查從無菌部位獲取待測樣本，則普通病人配合度低，重癥病人實施操作難度高；(2)培養需要較長時間，需要多次培養，部分鏡下檢驗需要由經驗豐富的檢驗人員操作。雖然新型培養基、自動化血培養系統能降低微生物培養時間，但沒有明確證據證明此類新進展能提升診斷敏感性[15]；(3)組織病理學檢查也是常用的診斷方法，但也缺乏敏感性和精確性，例如一種菌種，在鏡下會呈現不同形態。當需要根據菌種選擇藥物，將曲霉與其他真菌區分時，組織病理學結果常會出現問題 。

相比于組織培養，直接鏡檢更快捷，成本也更低。但主觀因素對直接鏡檢影響較大，且需要較高的檢驗技術，并且陰性不能明確排除真菌感染。影像學檢查特異程度較低，有時不能排除腫瘤及其他感染，并且在晚期才有較大特異征象，臨床意義有限。

2 血清學檢查又稱間接檢測方法

侵襲性真菌感染血清學檢測主要有兩種。第一種為抗原檢測，有G實驗、GM實驗、Mn(念珠菌甘露聚糖)實驗、GXM(隱球菌莢膜多糖)實驗等。第二種為抗體檢測，有特異性IgM、IgG抗體檢測。

G實驗檢測的是真菌細胞壁的1-3-β-D葡聚糖，1-3-β-D葡聚糖是大多數真菌細胞壁的組成部分，在真菌中是一種非特異成分，而在其他微生物和人類細胞中沒有BDG。真菌在被人體免疫系統消滅破壞后可以在一段時間內釋放出BDG至血液、胸腔積液、腹腔積液、腦脊液、尿液等體液中。G實驗是一種非特異性的篩查技術(隱球菌和接合菌除外)，已經公認為肺真菌感染的微生物學依據[16]。G實驗還可大致鑒別其是否為定殖菌。G實驗可分為三代。第一代和第二代樣本采用加熱和稀釋的方法，最后一代使用堿處理，第三代可以減少互相反應，提高準確度。第三代G實驗采用動態顯色法，檢驗時間約為1h。第三代穩定性高、抗干擾能力強、準確度高。同時在侵襲性感染早期診斷G實驗意義很大。但G實驗也有缺點，患者如果用纖維素膜進行血液透析，或者樣本接觸紗布等含有葡聚糖的物品，G實驗可能出現假陽性；患者使用抗菌藥物如頭孢噻肟、頭孢西丁、頭孢唑林、甲氧芐啶、頭孢吡肟等；患者靜脈輸注白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白；標本溶血、脂血、黃疸；癌癥患者使用多糖類抗癌藥，化放療破壞黏膜致胃內容物的葡聚糖或定殖真菌入血等也可致假陽性；此外，因為G實驗的檢測過程與內毒素很類似，故可被血中革蘭陰性菌的內毒素干擾，引起假陽性[3]。相關研究提示：在G實驗陽性的病例中，真菌培養陽性率為81.0%，而在G實驗含量正常的病例中，該比率為54.0%；就真菌培養結果來看，G實驗的敏感度是48.3%，特異度是95.0%。G實驗雖有一定的假陽性率，但其敏感度，特異度比真菌培養高，若G實驗與GM實驗同時檢驗，則能進一步提升真菌診斷率，對于侵襲性肺部真菌感染的診斷有很大幫助[28]。

GM實驗檢測的是半乳甘露聚糖。半乳甘露聚糖呈水溶性，對熱穩定，主要產生于曲霉菌。曲霉菌在體內及體外生長實驗中都可以釋放出該抗原，早期由菌絲分泌釋放，進入體液中，能持續1至8周。因此在真菌感染患者的血清、尿液、腦脊液及BALF等體液中都可以檢測出該種抗原的存在，因此本法常用于曲霉屬感染的篩查。國內外指南建議，患有血液病、重癥、腫瘤，或者進行器官移植手術等的高危患者可以使用GM實驗進行連續監測，GM實驗對肺曲霉病的診斷價值非常大。

念珠菌甘露聚糖為念珠菌細胞壁主要成分，是念珠菌感染的生物標志物，與念珠菌免疫反應有關。歐洲權威感染相關指南建議，念珠菌甘露聚糖實驗檢測念珠菌的多種感染[17]。Mn實驗陽性一般較血培養陽性早6-7天[18]。

對于抗體的檢測，歐洲權威學會與指南強烈推薦肺泡灌洗液GM實驗和血IgG 抗體檢測，美國傳染病學會最新指南推薦曲霉IgG抗體用于慢性空洞性肺曲霉病的診斷[16]。所以曲霉抗體檢測可以作為GM實驗的重要補充，增加確診率。

真菌感染血清學檢測也有一些缺點：(1)葡聚糖等成分分布于環境中各個位置，因此血清學檢測易出現假陽性結果[15,28]；(2)不能精確地鑒定菌種；(3)此法不能檢驗隱球菌和接合菌的感染，因為它們葡聚糖含量很少[19]；(4)不同循環抗原與抗體之間可能有交叉反應[20]；(5)由于抗真菌治療會導致真菌細胞壁釋放更少的半乳甘露聚糖，因此對于經驗性抗真菌治療的患者GM實驗沒有普通患者準確[21]。

3 未來真菌診斷技術的發展方向為分子診斷

傳統方法在早期診斷，快速診斷，精準診斷中都有著各種劣勢。早期，快速診斷能夠盡早地展開針對性的臨床治療，無論是痰培養，組織病理，真菌抗原，還是抗體檢測，DNA檢測，都不能確定菌種，定量測定，實現耐藥性檢測等，進而影響患者的預后。現今新型分子診斷技術不斷出現，為臨床診斷提供了新的機會與幫助，其中包括：傳統PCR、RT-PCR、MALDI-TOF MS、恒溫擴增、測序等，它們有著越來越多的優勢。

MALDI-TOF MS具有可檢測菌種種類多，一次檢測費用較少，特異性高，一次檢測樣本多，時間短，可多次檢測等特點，現在已經在全國大型醫院開展使用。因其可以精確識別蛋白譜，MALDI-TOF MS能對絲狀菌和酵母菌快速進行鑒別[22]。現在的重點研究方向之一是識別耐藥菌株及其分子分型，但仍不成熟，以往外國對于儀器的研發具有壟斷地位，隨著我國對科研的重視，對相關儀器將投入更多研究，將來越來越多的國產儀器會發揮作用。

和前面的方法相比，核酸診斷如PCR，恒溫擴增具有特異性高、靈敏度高、檢測時間短等特點，是真菌感染診斷新的強力助手，使識別之前難以培養鑒定的真菌變成可能，還可以進行耐藥性及其他快速測定，是未來具有很大前景的技術手段。

核酸診斷有兩個過程，它們分別為臨床患者DNA提取與核酸擴增。只有DNA成功提取，才能保證核酸擴增的進行。真菌細胞壁由甘露聚糖、糖蛋白、幾丁質、葡聚糖組成，它們組成了堅固的屏障，通過普通方法難以打開。目前沒有簡易可行的、普及的手段及標準，因此提取真菌的DNA很難，這是分子診斷行業前進的主要障礙，也是真菌感染核酸診斷領域研究的重點[23]。此外提取DNA常引起真菌診斷假陽性，相關研究顯示，3.3%假陽性是DNA在提取過程中出現[24]。今后真菌感染的DNA提取應該向智能、便捷的方向發展。

對于PCR和熒光PCR擴增，還沒有食品藥品監督管理局批準的真菌感染PCR 檢測手段，但已有許多廣泛使用的自行研發的PCR檢測方法，有研究選入 54 項共有 5000 例患者，此研究發現血清樣本PCR敏感性與特異性在“確診”或“可能”的侵襲性真菌感染中分別為 95%和 92%[24]。一項PCR診斷真菌感染的比較傳統的診斷方法是，先使用相對保守的引物(例如念珠菌，曲霉菌等真菌)檢測有無真菌感染，之后再使用特殊的引物(例如真菌種特異性引物)或其他方法(比如測序或限制性內切酶分析)來精確診斷[25-26]。與鏡下檢查、血液標本檢查的方法相比，核酸診斷的結果更迅速、更準確。因為核酸檢測靈敏度高，結果準確，可以使用臨床樣本試驗區別感染和定殖，還能連續監測用藥的結果。熒光PCR能顯著提高靈敏度并大幅降低氣溶膠污染，而終點PCR較差。但熒光PCR的檢測試劑和儀器都是高費用的技術，終點PCR價格相對低廉。

臨床上能否快速確診疾病，明確感染病原體，對于患者的預后和花費有著至關重要的影響。傳統組織培養，血清學檢查等方法均有不能鑒定菌種，無法定量，無法判斷耐藥性等缺點。越來越完善的分子生物及生物傳感器診斷手段會進一步彌補傳統檢測方法的不足，這些技術包括：MALDI-TOF MS、傳統PCR、RT-PCR、恒溫擴增、測序等。這些技術在臨床的應用中展現出越來越明顯的優勢。但目前由于其費用因素，主要應用于發達地區的醫療檢測機構中，使用人群大多為富裕人群，他們對檢測質量要求較高。而我國仍為發展中國家，大型儀器需要大量資金來維護設備以及雇用專業操作人員，偏遠地區無法負擔高昂的檢測費用，未來研發方向應為減少大型設備依賴，普及貧困地區使用率。

表1

侵襲性真菌感染的臨床診斷仍有困難，需要結合宿主危險因素、臨床表現、影像檢查和實驗室檢測，結合國家指南和我國情況，可以將診斷分為確診，臨床診斷和擬診。在診斷中，就檢測技術而言，雖然各種先進的檢測技術在不斷完善，但在臨床確診中仍需有血培養、無菌體液的真菌培養結果陽性或組織病理有陽性結果，臨床診斷需要有微生物學陽性結果，如合格痰液，支氣管肺泡灌洗液有兩次陽性發現，G實驗與GM實驗連續兩次陽性等[10]。在加大新技術應用的同時，仍應注重現有較成熟檢測技術的臨床應用。