4種獐牙菜屬植物的快速鑒別研究

繆明錦，黎氏文梅，趙飛亞，陶愛恩*

（1. 大理州食品藥品檢驗所，云南 大理 671000；2. 大理大學藥學院，云南 大理 671000；3. 云南大學旅游文化學院醫學院，云南 麗江 674199）

0 引言

青葉膽為龍膽科獐牙菜屬植物Svuertia mileensis T.N. Ho et W. L._Shih的干燥全草，具有退黃、除濕、舒肝健胃的功效[1]。在藏醫藥中作為治療肝炎、黃疸型肝炎、肝臟疾病的藥物[2]。主要含有環烯醚萜、三萜、生物堿等化學成分[3]，具有保肝、降血糖、抗菌及抗病毒等活性[3-4]。隨著近年來市場需求不斷增加，原料藥遠不能滿足市場需求。而且青葉膽野生資源的匱乏，且尚無人工種植，市場上出現了許多混偽品，常見為麗江獐牙菜、川西獐牙菜、大籽獐牙菜等，導致青葉膽臨床用藥的安全性和有效性得不到保證，嚴重干擾了藥材市場的正常運行，而且對中成藥生產造成極大干擾，因此有必要對青葉膽藥材及其混偽品進行快速鑒別。已有學者報道獐牙菜屬植物DNA鑒別[5]、UPLC指紋圖譜[6]、遺傳多樣性[7]，但尚未見紅外光譜結合多元統計學在青葉膽及其麗江獐牙菜、川西獐牙菜、大籽獐牙菜等混偽品的快速鑒別研究。鑒于此，本研究采用經典的形態鑒別和紅外光譜鑒別手段，探討青葉膽及其混偽品的異同，以期建立一種快速、準確高效的青葉膽真偽鑒定方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Nexus傅里葉變換紅外光譜儀(美國熱點尼高麗公司)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；FW-4A型粉末壓片機(天津市拓普儀器有限公司)。

1.2 材料

樣品采集于云南大理、彌勒，經大理大學藥學院夏從龍教授鑒定為青葉膽Swertia mileensis T. N. Ho et W. L._Shih、麗江獐牙菜Swertia delavayi、大籽獐牙菜Swertia macrosperma(C. B. Clarke) C. B. Clarke、川西獐牙菜Swertia mussotii Franch.，樣品信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法

2.1 原植物形態分析

4種獐牙菜屬原植物見圖1，比較莖、葉及花的特征。

2.2 供試品的制備

34批藥材干燥至恒重，粉碎過80目篩，備用。按照課題組前期方法制備供試品和數據處理分析[8]。

3 結果與分析

3.1 4種獐牙菜的形態鑒別

圖1 4種獐牙菜原植物圖

4種獐牙菜的植物形態特征見圖1。《中國華人民共和國藥典》(2015年版)收載的正品青葉膽莖呈四棱形，棱上具狹翅，花冠淡藍色，下部具兩個腺窩，腺窩杯狀，僅頂端具短柔毛狀流蘇。與其比較，麗江獐牙菜莖呈圓形，花冠黃綠色，基部有一圈紫暈，基部具1個腺窩，腺窩馬蹄形，有2個黑紫色斑點；大籽獐牙菜莖四棱形，花冠黃綠色，中部以上具黃綠色花紋，下部具一個腺窩，半圓形，上半部邊緣具短流蘇；川西獐牙菜莖四棱形，棱上具狹翅，花冠暗紫紅色，基部兩個腺窩，腺窩距圓形，邊緣具長柔毛狀流蘇。

3.2 4種獐牙菜的平均紅外光譜對比分析

4種獐牙菜的平均紅外光譜圖見圖2，主要吸收區域為900～400cm-1，1310～900cm-1，1500～1310cm-1，1800～1500cm-1，2800～3000cm-1，3000～3500cm-1附近，吸收峰主要集中在1800～500cm-1的范圍內，3000～3500cm-1波段寬而大的吸收峰為O-H伸縮振動[9]；2800～3000cm-1為烷烴C-H的伸縮振動1800～1500cm-1波段主要表征苯環的碳骨架彎曲振動以及C≡N，C=O、C=C等伸縮振動；1310～900cm-1波段為單鍵的伸縮振動區和部分含氫基團的彎曲振動；1500～1310cm-1主要代表了C-H的彎曲振動；900～400cm-1波段主要為烯的碳氫彎曲振動，苯環彎曲振動和面外彎曲振動等。從圖2的Ⅰ區中可以看出青葉膽與其混偽品比較出現向上的鋸齒吸收峰差異明顯，表明不同種之間整體化學成分存在差異。

圖2 4種獐牙菜的平均紅外圖譜

3.3 4種獐牙菜的二階導數紅外光譜對比分析

對紅外光譜進行二階導數處理，可以提高譜圖的分辨率[10]。對4種獐牙菜的紅外光譜進行二階導數求導，結果見圖3。從圖中可以看出，4種獐牙菜的主要鑒別區域為Ⅱ區(1000～900cm-1波段)和Ⅲ區(800～500cm-1波段)，在Ⅱ區，青葉膽、圈紋獐牙菜、顯脈獐牙菜有3個向上的“鋸齒”，而紫紅獐牙菜明顯有4個向上的“鋸齒”，在Ⅲ區，4種獐牙菜向上的“鋸齒”吸收峰數目均不同。進一步表明，青葉膽與其混偽品之間化學成分不同，麗江獐牙菜、大籽獐牙菜、川西獐牙菜能否替代青葉膽入藥，尚需研究。

圖3 4種獐牙菜的二階導數譜圖

3.4 PCA和PLS-DA分析

本研究對34批獐牙菜藥材的紅外光譜數據進行二階求導等預處，導入SIMCA-P13.0進行PCA和PLS-DA分析。在PCA得分圖中(圖4-a)，青葉膽單獨聚為一類，聚類效果較好；川西獐牙菜、麗江獐牙菜和大籽獐牙菜距離很近，但能明顯區分。在PLS-DA二維得分圖中(圖4-b)，青葉膽單獨聚為一類，川西獐牙菜、麗江獐牙菜和大籽獐牙菜聚為一大類，PLS-DA聚類結果優于PCA分析。PCA和PLS-DA均能把青葉膽及其混偽品鑒別。

3.5 HCA分析

本研究對34批獐牙菜藥材的紅外光譜數據進行坐標歸一化、二階求導等預處，導入SPSS 22.0得到數據矩陣，應用Ward聚類法進行系統分析[14]，如圖5。可以看出，距離為25時，4種獐牙菜可聚為1類，在距離系數為20處，4種獐牙菜聚為2類，青葉膽單獨聚為一類，川西獐牙菜，麗江獐牙菜，大籽獐牙菜聚為一類。在距離系數為5處，大籽獐牙菜單獨聚為一類，江獐牙菜與川西獐牙菜距離較近，但也能分開，HCA的聚類效果與PCA和PLS-DA分析結果一致。

4 討論

圖4 4種獐牙菜的PCA（a）和PLS-DA（b）二維得分圖

本研究采用形態鑒別和紅外光譜探討4種獐牙菜屬植物形態和整體化學成的差異。形態特征結果表明，與正品青葉膽比較，其余3種獐牙菜形態特征存在明顯差異，可作為青葉膽及其混偽品的形態鑒別依據。紅外結果表明，4種獐牙菜平均圖譜1500～500cm-1波段，二階導數圖譜1000～900cm-1和800～500cm-1波段內差異較大，PCA、PLS-DA、HCA均能將青葉膽與其混偽品區分，表明4種獐牙菜整體化學成分差異較大，紅外光譜可作為青葉膽及其混偽品化學鑒別依據。青葉膽屬于2015年版《中國藥典》收載的正品藥材，主要分布于云南彌勒，資源瀕危嚴重，川西獐牙菜在藏藥中有記載用于治療肝炎、黃疸型肝炎、肝膽疾病[2]，麗江獐牙菜具有治療病毒性肝炎[15]，大籽獐牙菜具有保肝作用[16-18]，但通過形態和整體的化學成分分析，4種獐牙菜差異較大，麗江獐牙菜、大籽獐牙菜和川西獐牙菜能否替代青葉膽入藥還需進一步研究。本研究采用形態結合紅外光譜可對青葉膽及其混偽品快速鑒別，為青葉膽質量評價提供一種科學方法。

圖5 4種獐牙菜的HCA圖