UPLC法對大理州滇重樓的品質評價研究

管鑫，楊青淑，段寶忠,2，張海珠,2，夏從龍,2*

(1.大理大學藥學與化學學院，云南 大理 671000；2.云南省高校滇西道地藥材資源開發重點實驗室，云南 大理671000)

0 引言

重樓為百合科重樓屬植物(Paris L.)的總稱，以“蚤休”之名始載于《神農本草經》。2015版《中國藥典》收載了滇重樓Paris polyphylla Smith var. Yunnanensis(Franch.)Hand-Mazz.和七葉一枝花Paris. polyphyllaSmith var.chinensis(Franch.)Hara，以其地下根莖入藥，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚等功效，是“云南白藥”、“季勝德蛇藥片”等著名中成藥的主要原料[1-5]。該屬植物主要含有甾體皂苷類、三萜類、黃酮類化合物，具有鎮痛、止血、抗腫瘤、抑菌等活性[6,7]。

在李恒分類系統[8]下，重樓屬共24個種，分布在歐亞大陸的熱帶及溫帶地區，我國有19種，分布較廣，特別是在云南、貴州、四川等高海拔的西南省區種類最為豐富。其中，大理州有悠久的種藥和用藥傳統，獨特的民族文化為民族藥業的發展奠定了深厚的基礎，是云南省種植重樓等道地藥材，發展“云藥”產業的重要原料基地[7,9]，滇重樓又為藥典收載的品種。因此，本實驗對大理州滇重樓進行研究。由于重樓種子休眠時間長，生長過程也十分緩慢，從種子萌發到可作為藥材收獲一般需要較長時間。而重樓作為多種中成藥的主要原料，需求市場遠遠大于供應市場，導致其供不應求，價格昂貴，近幾年來甚至突破1000元/kg[7,9]。雖已有學者對重樓采收年限進行研究[12,13]，但尚未有大理區域內滇重樓的種植規化研究，因此，我們可以通過UPLC法對大理滇重樓根莖中5種重樓皂苷(Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、H)進行含量測定，并對其進行分析比較，為探究大理滇重樓采收年限及種植區域規化提供一定參考依據。

1 材料

儀器：Agilent 1290 超高效液相色譜儀(美國Agilent有限公司公司)、超聲波清洗機(SB25-12D型，寧波新芝生物科技股份有限公司)、分析電子天平、十萬分之一電子天平(AL104型，梅特勒-托利多上海有限公司)、FY135型中草藥粉碎機(永康市金穗機械制造廠)。

對照品與試劑：對照品重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ、(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為111590-201604、111591-201604、111592-201604、111593-201604，純度均達98%以上)，重樓皂苷H(北京融誠鑫德科技發展有限公司，批號分別為C-035-161001，純度達98%以上)，色譜級乙腈，水為哇哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

供試藥材：9批(S1-S9)樣品均為8年生重樓，來自大理州不同地區，5批(Y1～Y5)樣品均采自大理永平基地，分別為5、6、7、9、10年生重樓，經大理大學藥學與化學學院生藥學教研室夏從龍教授鑒定為百合科(Lilliaceae)重樓屬(Paris L.)滇重樓Paris polyphylla Smith var. Yunnanensis(Franch.)Hand-Mazz.，樣品信息見表1。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取各對照品0.0030g，加甲醇溶解后定容到10mL容量瓶中，搖勻，配成的對照品的濃度分別為重樓皂苷Ⅰ為0.3592g/L，重樓皂苷Ⅱ為0.3425g/L，重樓皂苷Ⅵ為0.3386g/L，重樓皂苷Ⅶ為0.3335g/L，重樓皂苷H為0.3288g/L。

2.2 供試品溶液的制備

將各供試藥材粉碎，稱取各供試藥材0.5g，放入具塞錐形瓶中，加3mL甲醇后超聲30min，重復三次，均取上清液過濾后用甲醇定容到10mL容量瓶中，搖勻，用時用0.22μm的微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 色譜條件

資生堂C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，流動相乙腈(A)-水(B)梯度洗脫(0-2min，28%-30%A；2-9min，30%A-36%A;9-14min，36%A-39%A；14-19min，39%A-44%A；19-32min，44%A-50%A；32-50min，50%A)見表1，檢測波長203nm，流速0.8mL·min-1，柱溫25℃，進樣量10μL。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察

取對照品溶液分別進樣1、2、4、6、8、10μL，在2.3色譜條件下，將圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”得到重樓皂苷I 、II、VI、VII、H對照品峰面積。以對照品進樣量(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，得到準曲線見表2。

2.4.2 精密度試驗

取S1的供試品溶液，進樣量為10μL，按上述色譜條件，連續進樣6次，峰面積RSD均＜1.0%，表明此方法精密度較好。

2.4.3 重復性試驗

取6份S1供試品溶液，按上述色譜條件，每次進樣量為10μL，峰面積RSD均＜3%，表明該方法重復性較好。

2.4.4 加樣回收率試驗

取6份S1樣品，每份約0.5g，分別加入重樓皂苷I、重樓皂苷II、重樓皂苷VI、重樓皂苷VII、重樓皂苷H，按上述方法制備，測得加樣回收率為99.12%、98.88%、98.67%、98.22%、99.08%。且RSD為0.32%～0.95%。

2.5 結果與分析

2.5.1 大理州同產地不同生長年限滇重樓根莖主要皂苷類成分含量分析

大理州同產地(大理永平基地)分別為5、6、7、8、9、10年生滇重樓含量測定色譜圖，見圖1。不同年限滇重樓根莖中重樓皂苷I、II、VI、VII、H及2015版《中國藥典》規定重樓皂苷I、II、VI、VII的總含量，見表3。結果顯示，不同年限滇重樓根莖中均檢測到2015版《中國藥典》規定重樓皂苷I、II、VI、VII，其總含量范圍在1.186～4.170%，均大于2015版《中國藥典》規定的0.60%的質量控制標準，大理州不同生長年限滇重樓根莖中重樓皂苷的總含量總體呈現出先上升后下降趨勢，5～8年總含量逐年增加，8年總含量為最高，9年以上生重樓皂苷總含量較7、8年生均減少，因此，建議大理滇重樓采收季節在7～8年。

表1 滇重樓的樣品信息表

表2 重樓皂苷I、II、VI、VII、H 線性范圍考察

圖1 大理永平基地5～10年生滇重樓UPLC圖譜

圖2 重樓皂苷I、II、VI、VII、H混合對照品（A）及滇重樓根莖（B）色譜圖

表3 大理永平基地5～10年滇重樓含量測定結果

表4 大理州不同地區8年生滇重樓含量測定結果

2.5.2 大理州不同產地滇重樓根莖主要皂苷類成分含量分析

大理州不同產地滇重樓根莖中重樓皂苷I、II、VI、VII、H含量，見表4，色譜圖見圖2。結果顯示，大理州不同產地滇重樓根莖中均檢測到藥典規定的4種重樓皂苷I、II、VI、VII，其總含量的范圍在0.765%～4.170%，均大于2015版《中國藥典》一部規定的0.60%的質量控制標準，5種重樓皂苷總含量由大到小依次為S5(大理永平基地)＞S6(大理鶴慶)＞S1(大理大學教學實踐基地，大理古城)＞S3(大理漕澗)＞S7(大理劍川)＞S4(大理巍山青華村)＞S2(大理賓川)＞S9(大理漾濞箐口村)＞S8(大理巍山三鶴村)，其中含量最高的為S5(大理永平基地)，最低的為S8(大理巍山三鶴村)，相差5倍多。大理州不同產地8年生滇重樓主要成分含量存在差異，但總體品質都達到藥典標準。對于大理州種植區域以大理永平，大理鶴慶，大理大學教學實踐基地(大理古城)為佳，五種重樓皂苷(I、II、VI、VII、H)總含量均大于1.5%。

3 討論

筆者對大理永平基地不同年限6批(Y1～Y5，S5)滇重樓根莖中重樓皂苷I、II、VI、VII、H進行含量測定，6批樣品均檢測到5種重樓皂苷(I、II、VI、VII、H)。結果顯示，大理不同生長年限滇重樓根莖中5種重樓皂苷的總含量總體呈現出先上升后下降趨勢，5～8年5種重樓皂苷含量隨年限增長而增加，9年及以上生滇重樓較7、8年生5種重樓皂苷含量均減少，含量最高的為8年生滇重樓。考慮時間、成本等因素，建議大理滇重樓采收年限為7～8年。這與趙庭周等[13]研究結果吻合，滇重樓中重樓皂苷含量隨生長年份的增長而增加，第7年含量較高。也有相關文獻對重樓其他種進行研究[9-10]，如南重樓，長柱重樓等，研究發現采收期也在7～8年。對不同產地9批(S1～S9)8年生滇重樓根莖中重樓皂苷I、II、VI、VII、H進行含量測定，9批樣品均檢測到5中重樓皂苷(I、II、VI、VII、H)。結果表明，大理州不同地區同年生滇重樓5種重樓皂苷含量存在差異，5種重樓皂苷總含量由大到小順序依次為S5(大理永平基地)＞S6(大理鶴慶)＞S1(大理大學教學實踐基地，大理古城)＞S3(大理漕澗)＞S7(大理劍川)＞S4(大理巍山青華村)＞S2(大理賓川)＞S9(大理漾濞箐口村)＞S8(大理巍山三鶴村)，含量最高的大理永平基地與含量最低的大理巍山三鶴村相差5倍多，其中永平、鶴慶、大理大學教學實踐基地5種重樓皂苷總含量均大于1.5%，大于藥典規定量的2.5倍，因此，大理滇重樓種植基地建議在大理永平、大理鶴慶、大理大學教學實踐基地。

本實驗通過超高效液相色譜法對大理州同地區不同生長年限及不同地區同生長年限滇重樓根莖中處理皂苷含量進行測定，為大理州滇重樓采收時間及種植區域規化提供了一定的參考依據，但尚未涉及大理州全部地區，今后還將收集檢測更多大理州不同地區滇重樓的樣品，為大理州種植區域規化得出進一步的結論。