NaCl協同高壓電場提高紫花苜蓿輻射敏感性的研究

徐凱迪 陳浩 宋智青 丁昌江

摘要 以紫花苜蓿為誘變材料，通過研究NaCl和高壓電場的協同作用，探究高壓電場誘變紫花苜蓿的有效方法。結果表明，經過NaCl和高壓電場的協同處理后，存活率達到對照組的50%以下，處理組紫花苜蓿的莖長、根長、苗高和鮮重都比對照組低，活性氧（ROS）含量較對照組顯著升高。結果表明，NaCl能夠提高電場對紫花苜蓿的輻射敏感性。同時，為研究高壓電場中的非均勻電場和離子風的各自貢獻，利用高壓電場加遮擋處理紫花苜蓿，結果證明，在NaCl與高壓電場的協同作用中，離子風起了重要的作用。該研究找到NaCl與高壓電場聯合處理提高紫花苜蓿致死率的方法，并為紫花苜蓿的誘變工作提供了新方法，為高壓電場誘變技術更廣泛的應用提供了試驗基礎。

關鍵詞 NaCl;高壓電場;紫花苜蓿;輻射敏感性

中圖分類號 S541+.1? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）04-0001-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.04.001

Study of NaCl Cooperating with High Voltage Electric Field to Improve Radiosensitivity of Alfalfa

XU Kai-di，CHEN Hao，SONG Zhi-qing et al （College of Science，Inner Mongolia University of Technology，Hohhot，Inner Mongolia 010051）

Abstract Alfalfa was used as the mutagenesis material to explore the effective method of mutagenesis of alfalfa by HVEF through studying the synergistic effect of NaCl and HVEF.The experimental results showed that after the synergistic treatment of NaCl and HVEF，the survival rate was less than 50 percent of the control group，the stem length，root length，seedling height and fresh weight of alfalfa in the treatment group were lower than that in the control group，and the content of reactive oxygen species （ROS） was significantly higher than that in the control group.The experimental results showed that NaCl could improve the radiosensitivity of HVEF to alfalfa.

At the same time， in order to study the contribution of non-uniform electric field and ion wind in high voltage electric field， alfalfa was treated with high voltage electric field and shielding. The results showed that ion wind played an important role in the synergy of NaCl and high-voltage electric field.

In this research，a method was found to increase the fatality rate of alfalfa treated with NaCl combined with HVEF，which provided a new method for the mutagenesis of alfalfa and provided an experimental basis for the wider application of HVEF mutagenesis technology.

Key words NaCl;High voltage electric field;Alfalfa;Radiosensitivity

基金項目 國家自然科學基金項目（51767020）;內蒙古自然科學基金項目（2020MS01016，2019MS06025）。

作者簡介 徐凱迪（1993—），男，安徽蚌埠人，碩士研究生，研究方向：電磁生物技術。通信作者，高級實驗師，博士，從事環境生物物理方面的研究。

收稿日期 2020-07-23

紫花苜蓿是多年生豆科開花植物，它具有產量高、適應性強、草質優良、易于家畜消化等特點，是養殖業首選飼料，在畜牧業、農業耕作及生態環保等方面起著非常重要的作用[1]。目前，天然草地的劣變導致飼草產量降低、品質下降，草畜失衡的矛盾日益加劇，嚴重制約了畜牧業可持續發展。紫花苜蓿的誘變育種工作具有重要的意義。當前對于紫花苜蓿已有變異性的發掘利用，還遠未接近理論上生產能力。因此，誘變育種方法的改進和創新顯得十分重要。

高壓電場（high voltage electric field，HVEF）誘變技術是一種新型的物理誘變技術，它是通過將生物樣品放在下極板上，然后給上極板（針狀、線狀等不同形狀的電極）加一定幅度的直流或交流高電壓，在兩電極間形成電暈電場實現物理誘變。該誘變技術具有裝置簡便、能耗低、不污染環境、樣品熱效應低和誘變率高等優點，已獲得中國實用新型專利授權[2-3]。電暈電場是能產生局部電暈放電的非均勻電場。在非均勻電場中，電極的尖端處電力線最集中，電場強度也最大。當前的研究認為，高壓電暈電場誘變效應是2種物理因素協同作用產生的：一種是非均勻電場的作用;另一種是電暈放電產生的低溫等離子體在電場作用下形成離子風，離子

風會對生物體產生沖擊作用。已有的研究發現，利用高壓電暈電場可產生多種生物效應，例如可獲得高效高產的突變菌;可以提高豌豆、小麥、番茄、穿心蓮等多種植物種子的萌發、生長和產量;可對小麥和刺桐種皮產生刻蝕作用，進而使其吸水能力提高等[4-9]。將高壓電場誘變技術應用于紫花苜蓿的誘變育種工作具有重要的意義。

該研究首先利用高壓電場對紫花苜蓿干種子進行處理，結果顯示電場處理對紫花苜蓿種子的萌發沒有顯著影響。在誘變育種工作中，通常選擇處理組相對致死率為50%（甚至更高）為合適的誘變劑量。當前的處理方式還達不到誘變育種的要求。研究表明，NaCl會提高細胞和微生物的輻射敏感性，從而增強輻射損傷[10-11]。將NaCl和高壓電場誘變技術聯用，擬研究協同處理對紫花苜蓿存活率和初期生長的影響，以期找到高壓電場誘變紫花苜蓿的有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料 供試的紫花苜蓿種子為中草3號，由中國農業科學院草原研究所提供。試驗前篩除不良籽粒，蒸餾水沖洗表面雜質及浮土。

1.2 儀器 試驗裝置如圖1所示。電源為交流電，電壓為0～50 kV連續可調，頻率為50 Hz。電極系統為針橫縱間距均為4 cm、針長為2 cm的多針-板極陣列，接地端為平面鋁板，電極尖端到接地端的距離為4 cm。

1.3 方法

1.3.1 高壓電場對紫花苜蓿干種子的處理。

將篩選后的干種子均勻擺放在直徑為10 cm、含有3層濾紙的培養皿內，每個培養皿50粒種子。對紫花苜蓿干種子進行電場處理，電壓為臨近擊穿電壓，處理時間為10、20、30和40 min，處理完后測其發芽率。

1.3.2 NaCl適宜濃度的篩選。

為了研究NaCl對高壓電場作用效果的影響，希望找出NaCl單獨作用對紫花苜蓿萌發沒有影響的濃度。將篩選后的干種子均勻擺放在直徑為10 cm、含有3層濾紙的培養皿內，每個培養皿50粒種子。NaCl濃度分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，設置對照組，每隔1 d更換培養皿中的濾紙，以保持NaCl濃度和水分恒定。待第8天測其發芽率。

1.3.3 NaCl協同高壓電場對紫花苜蓿種子的處理。

對紫花苜蓿種子進行48 h左右的預處理（分別浸泡于NaCl和去離子水中），等種子吸脹、萌動后再進行電場處理。采用的電壓為17 kV、NaCl濃度為0.8%（通過NaCl濃度篩選試驗發現，0.8% NaCl處理紫花苜蓿的發芽率與對照組沒有太大變化）。把種子分為6組，每組3皿，分別記為NaCl+HVEF、HVEF、NaCl、對照組（Con）、NaCl+HVEF+Cov（加厚度為1 mm的聚丙烯培養皿蓋遮擋，簡稱NHC）、HVEF+Cov（簡稱HC）。高壓電場處理方式為先在電場下處理4 h，關閉電場，待12 h后，再繼續電場下處理4 h。在電場下處理時，待濾紙快干時更換濾紙。每次處理重復3次。

1.3.4 存活率檢測。

將處理完的種子放在含有3層濾紙的培養皿中，每隔1 d更換每個培養皿中的濾紙，以保持NaCl濃度和水分恒定。將種子置于光照培養箱中26 ℃恒溫培養，種子出芽后，給光照培養箱加140 lx光照條件，連續光照14 h、黑暗10 h進行培養，8 d后統計存活率。經高壓電場處理后，HVEF、NaCl、Con、NaCl+HVEF+Cov、HVEF+Cov 這5組以種子發芽率為存活率，通過觀察發現經NaCl+HVEF處理后，紫花苜蓿幼苗在長勢上不如3組對照且萌發后的種子接下來也會慢慢凋亡，所以規定經NaCl+HVEF處理后，紫花苜蓿幼苗苗高在3.5 cm（包括3.5 cm）以上時能夠成活。

1.3.5 形態學檢測。培養8 d后分別測量其莖長、根長和苗高，并測量第2、4、6、8天的鮮重。

1.3.6 幼苗活性氧（ROS）含量測定。

分別在接種第2天隨機選取0.2 g同一處理的幼苗冰浴研磨后進行ROS的測定，檢測采用的底物是2′，7′-二氯氫化熒光素乙二酯。采用Sudhakar等[12]的方法，待測樣品用10 mmol/L的CM-H2DCFDA在25 ℃下黑暗反應30 min，然后放入酶標儀（SPECTRAMAX I3，MOLECULAR DEVICES Corporation，USA）中，以485 nm的激發光激發，檢測530 nm發射光的熒光強度。6次以上重復。

1.3.7 數據分析。所有處理都至少進行3次重復，數據取平均值±標準偏差。采用SPSS統計軟件和單因素方差分析（ANOVA）分析數據差異，P<0.05認為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 高壓電場對紫花苜蓿干種子發芽率的影響

由圖2可知，在電壓為20 kV時，隨著處理時間的增加，紫花苜蓿的發芽率并沒有明顯變化。說明在臨近擊穿電壓下，處理時間對紫花苜蓿發芽率無太大影響。選用NaCl對紫花苜蓿種子進行預處理之后，再放在電場下進行處理，以期找到高壓電場對紫花苜蓿半致死的方法。

2.2 NaCl適宜濃度的篩選 由圖3可知，在0.2%、0.4%、0.6、0.8%的NaCl中，紫花苜蓿干種子的發芽率同對照組相比沒有顯著變化。當濃度為1.0%時，紫花苜蓿干種子的發芽率開始下降。0.8% NaCl是紫花苜蓿適宜的濃度。

2.3 NaCl協同高壓電場對紫花苜蓿存活率的影響 由圖4可知，在經高壓電場（HVEF）、NaCl處理后無論有無遮擋的種子，它們的存活率與對照組（Con）相比差異都不明顯。但經NaCl+HVEF處理后，紫花苜蓿存活率最低，并與其他組有顯著性差異。

2.4 NaCl協同高壓電場對紫花苜蓿莖長、根長和苗高的影響 由圖5可知，莖長在6種處理下，NaCl與HVEF、NHC、HC組之間無顯著差異;從根長看，NHC與NaCl、HVEF、Con組之間無顯著差異，HC與NaCl、Con組之間無顯著差異;從苗高看，NaCl、HVEF、HC、NHC這4組之間無顯著差異。從整體可以看出，NaCl+HVEF處理的紫花苜蓿莖長、根長和苗高最短，且與其他5組有顯著差異。

2.5 NaCl協同高壓電場對紫花苜蓿幼苗鮮重的影響

由圖6可知，高壓電場處理之后，在第8天，NaCl與HVEF、NHC、HC之間無顯著差異，但經過NaCl+17 kV處理過的紫花苜蓿幼苗鮮重最低，且與其他5組有顯著差異。

2.6 高壓電場處理后紫花苜蓿幼苗ROS含量的變化

研究表明，ROS在介導DNA損傷以及輻射誘導的旁效應方面非常重要[13-15]。為檢測ROS是否起到了重要作用，定量檢測了輻射后ROS的產生，結果表明，處理組ROS含量顯著高于對照組。

3 討論

該研究以中草3號紫花苜蓿種子為試材，用NaCl協同高壓電場共同作用于紫花苜蓿，觀察其幼苗形態指標，結果表明，NaCl和高壓電場共同處理紫花苜蓿種子達到了誘變育種對存活率的要求，NaCl和高壓電場分別單獨作用紫花苜蓿，對其存活無顯著影響，說明NaCl可以提高高壓電場對紫花苜蓿的輻射敏感性。經過處理后，紫花苜蓿莖長、根長、苗高和鮮重較對照組顯著降低。這表明NaCl協同高壓電場共同作用于紫花苜蓿，可以使紫花苜蓿的生長活力降低，進而使紫花苜蓿生長緩慢。

通常認為，種子在吸脹萌發期間，細胞膜的完整性和修復能力是影響種子萌發的重要因素。膜修復快，外滲物質少，種子活力則較高;反之，外滲物質多，種子活力則較低。過高的電場將產生過大的顯質力和場致伸縮應力，不僅無助于膜相和功能的恢復，而且可能會進一步破壞種子的膜相，導致種子活力大大降低。該研究顯示，在去離子水和高壓電場作用下，紫花苜蓿的莖長、根長、苗高和鮮重都比在去離子水中低，且有顯著差異，這表明高的電場會使種子活力降低，但達不到誘變育種的條件。經過NaCl和高壓電場共同作用過的紫花苜蓿在所測指標上更低，這可能是NaCl加深了電場對種子細胞膜的破壞，外滲物質增多，使種子活力降低。

高壓電場生物技術是一種新型高效的生物誘變技術，高壓電場生物效應是由多種因素協同復合作用產生的。對其物理特性分析可知，高壓電場的生物效應主要由2種因素作用形成：一是非均勻電場的作用，二是放電等離子體的作用。為了進一步探究高壓電場中兩因素的各自作用及貢獻，在處理紫花苜蓿種子時，一組直接暴露于高壓電場中，一組加培養皿蓋遮擋，以阻斷離子風對種子的物理化學刻蝕。結果發現，當有培養皿蓋遮擋時，通過對NaCl、NaCl+HVEF、NHC這3組處理進行分析，無論是莖長、根長、苗高，還是鮮重，都可以說明在NaCl與高壓電暈電場的協同作用中，離子風起到了重要的作用。

高壓電場非均勻放電同時還產生一些化學物質，如活性氧（ROS）。研究表明，ROS在細胞增殖、分化和凋亡中發揮著重要作用，并且擁有信號分子的功能。ROS是電磁因果鏈原初作用中連接物理和生物解釋的一個重要標志，等離子體作用后，在細胞基質中產生的ROS進入細胞，與細胞中的大分子發生作用，從而改變細胞的代謝活性和遺傳特性。大量研究表明，ROS在高濃度下對有機體極其有害，而在低濃度下，ROS能作為第二信使介導植物對激素或環境脅迫的多種應答反應[16-17]。NaCl協同高壓電場共同作用過的紫花苜蓿ROS含量比對照組高很多，這表明紫花苜蓿所受的損傷程度更高，不利于種子生長。

4 結論

NaCl可以增強高壓電場對紫花苜蓿輻射敏感性，提高致死率;在NaCl與高壓電暈電場的協同作用中，離子風起到了重要作用;NaCl協同高壓電場的處理方法可以應用于紫花苜蓿的誘變育種工作。

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