響應面法優化山地五月茶黃酮提取工藝

范春雅 樊雪瓊 郭教玲 謝世瑩 李娟 周丹

(海南醫學院藥學院 海南海口 571199)

山地五月茶（Antidesma montanum），是大戟科五月茶屬植物，主產于廣東、海南、廣西等地。五月茶屬植物通常以根、葉、莖入藥，具有健脾、抗炎、抗菌、鎮痛、生津、活血、收斂、解毒等功效［1］。山地五月茶，在海南分布廣泛。民間常將其與眼樹蓮合用治療眼疾。前期研究表明，山地五月茶安全無毒，有很好的藥理活性和開發前景［2-3］。

黃酮類化合物是植物界分布最為廣泛的一大類次生物質，具有很好的藥理生理活性，如治療心腦血管系統和消化、呼吸系統疾病；抗癌、鎮痛、抗炎、抗菌，消除自由基、抗氧化、抗衰老等，抗病毒及提高機體免疫力等，已被列為保健食品的一類功能因子［4-5］。黃酮的提取方法有溶劑提取法、吸附法、超臨界流體萃取法、堿溶酸沉法等。溶劑法是提取黃酮類化合物最常用的方法，此法操作簡單、易行。李萍［6］用溶劑法提取蘋果屬植物葉片中的類黃酮，發現影響提取率的關鍵因素有提取劑濃度、料液比，其次為提取溫度和時間；此外，類黃酮在提取過程中可能會發生氧化反應，可采用在提取劑中加入BHT（二丁基羥基甲苯）、抗壞血酸等還原劑加以預防。黃酮的測定方法主要有紫外分光光度法、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）等［7-10］。紫外分光法能快速地測出黃酮的含量，操作簡便，因而得到廣泛應用［11］。

本研究旨在探討山地五月茶總黃酮的提取工藝，并采用響應面法優化提取工藝條件，為山地五月茶的研究開發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材與試劑

山地五月茶地上部分采自海南省萬寧市興隆縣，經海南醫學院曾念開教授鑒定為山地五月茶（Antidesma montanum）。

蘆丁標準品（批號20771，上海源葉生物科技有限公司）、無水乙醇（西隴科學股份有限公司）、亞硝酸鈉（西隴科學股份有限公司）、氫氧化鈉（西隴化工股份有限公司）、硝酸鋁（天津市科密歐化學試劑有限公司）。所有試劑級別均為分析純，實驗用水為蒸餾水。

1.1.2 儀器

UV 1800C型紫外可見分光光度計（上海鳳凰儀器有限公司）；AE100 型電子分析天平（南京庚辰科學儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 山地五月茶黃酮的提取與含量測定

1.2.1.1 山地五月茶黃酮的提取

準確稱取2 g 樣品粉末于100 mL 圓底燒瓶中，加入60%乙醇20 mL，于80℃下加熱回流提取2 h，離心過濾；提取3 次，合并濾液，用60%乙醇定容至100 mL，即得山地五月茶樣品溶液［12］。

1.2.1.2 標準曲線的繪制

準確稱取干燥蘆丁標準品20 mg于50 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，搖勻，即得濃度為0.400 0 g/L的標準溶液［13］；準確吸取蘆丁標準液0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、3.50 mL 于比色管中，分別加入5%NaNO2溶液1.00 mL，搖勻后靜置6 min；加入10%Al（NO3）3溶液1.00 mL，搖勻后靜置6 min，加入4% NaOH 溶液4.00 mL，用無水乙醇定容至10 mL，搖勻并靜置10 min，于500 nm 處測定吸光度。以吸光度A為縱坐標，濃度C（g/L）為橫坐標［10］，繪制標準曲線。

1.2.1.3 黃酮含量的測定

準確移取1.00 mL 樣品液于比色管中，按“1.2.1.2 標準曲線的繪制”測定吸光度；根據標準回歸方程計算黃酮得率。總黃酮得率公式如下（Y）：

Y=CV/M

式中：Y為黃酮得率，單位為1；C為提取液濃度，g/mL；V為提取液原始體積，mL；M為所稱取山地五月茶粉末質量，g。

1.2.2 山地五月茶黃酮提取工藝優化

以乙醇為溶劑對山地五月茶進行加熱回流提取，結合單因素試驗，利用響應面法對山地五月茶黃酮的提取工藝進行優化。

1.2.2.1 單因素實驗

分別考察乙醇濃度、料液比、提取時間和提取溫度對山地五月茶加熱回流提取效果的影響（表1），黃酮含量測定方法同“1.2.1.3 黃酮含量的測定”。

表1 加熱回流提取的條件

1.2.2.2 響應面法優化提取工藝

結合上述單因素試驗結果，采用4 因素3 水平進行響應面法優化設計，試驗因素與水平如表2所示。自變量的試驗水平分別以-1、0、1 進行編碼，共設計29個試驗點。

表2 試驗因素與水平設計

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制與黃酮含量的測定

按“1.2.1.2 標準曲線的繪制”，依次測得各標準溶液吸光度。以濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線，結果如圖1所示。線性方程為A=0.229 4C+0.023 7，相關系數r=0.999 1。

圖1 標準曲線

2.2 山地五月茶黃酮提取工藝優化

2.2.1 單因素實驗

2.2.1.1 乙醇濃度對提取效果的影響

在提取時間為1 h、料液比為1∶40、提取溫度為60℃、提取3 次的條件下，考察不同乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%）對山地五月茶黃酮提取效果的影響，結果如圖2 所示。由圖2 中可知，乙醇濃度對樣品中黃酮的提取影響較大，隨著乙醇濃度的增加，黃酮的含量呈先升高而后下降的變化趨勢；當乙醇濃度為50%時，總黃酮含量最高。這說明山地五月茶中中等極性的黃酮苷類物質含量比較高，當乙醇濃度大于50%時，溶劑極性降低，導致部分黃酮苷類物質不能溶解，某些脂溶性雜質溶出，使黃酮提取率降低。因此，最佳乙醇濃度為50%。

2.2.1.2 料液比對加熱回流提取效果的影響

圖2 乙醇濃度對提取效果的影響

在提取時間為1 h、乙醇濃度為60%、提取溫度為60℃、提取3 次的條件下，考察1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 料液比對山地五月茶黃酮提取效果的影響，結果如圖3所示。當料液比為1∶30 時，總黃酮提取率達到峰值。繼續提高料液比，黃酮提取率反而下降。這可能是因為已浸出的大量雜質影響了黃酮的浸出率；或者是因為已浸出的大量黃酮對剩余黃酮有協同浸提作用［9］。

圖3 乙醇體積對提取效果的影響

2.2.1.3 提取時間對加熱回流提取效果的影響

在提取溫度為60℃、料液比為1∶40、乙醇濃度為60%、提取3次的條件下，考察提取時間（30、60、90、120、150 min）對山地五月茶黃酮提取效果的影響，結果如圖4 所示。從圖4 可知，黃酮含量隨著提取時間的延長而升高，當提取時間為90 min 時，黃酮含量達到極值，之后又逐漸降低。因此，最佳提取時間為90 min。

2.2.1.4 提取溫度對加熱回流提取效果的影響

在提取時間為1 h、料液比為1∶40、乙醇濃度為60%、提取3次的條件下，考察不同溫度（50、60、70、80、90℃）對山地五月茶黃酮提取效果的影響，結果如圖5 所示。從圖5 可知，黃酮含量隨著提取溫度的升高呈現先升后降的趨勢，在溫度為80℃時含量最高。這是因為升溫加速了黃酮類物質的滲透、擴散、溶解等，更有利于黃酮的提取；但過高的溫度易使黃酮類物質氧化變性，從而導致提取率下降［7］。因此，最佳提取溫度為80℃。

圖4 提取時間對提取效果的影響

圖5 提取溫度對提取效果的影響

2.2.2 響應面法優化提取工藝

2.2.2.1 回歸方程建立與方差分析

根據單因素試驗結果，以料液比（A）、乙醇濃度（B）、提取溫度（C）、提取時間（D）為自變量，山地五月茶黃酮得率為因變量進行響應面法設計（表2），共設計29 個試驗點，響應面法優化提取工藝分析方案及結果如表3所示。

利用Design-Expert 8.0 軟件對表3 的數據進行分析，方差分析結果見表4。由表4 可知，料液比（p＜0.01）和乙醇濃度（p＜0.50）對總黃酮的提取影響顯著。以山地五月茶中總黃酮得率（Y）為響應值，經回歸擬合后，得到回歸方程：

Y=0.866-2.95×10-3A+6.415×10-3B-0.015C-6.56×10-3D+3.75×10-5AB+5.5×10-5AC+2.5×10-5AD+3.5×10-5BC+1.08×10-5BD+6.92×10-5CD-7.02×10-5A2-1.08×10-4B2+3.67×10-5C2-2.04×10-6D2

表3 響應面優化分析方案

由表4 可知，該模型顯著（p= 0.0048＜0.05），失擬項不顯著 （p= 0.9045＞0.05），決定系數R2=0.812 5，說明有81.25%的變差能夠由該模型解釋；變異系數CV為8.94%，說明變異（偏離）程度較小。因此，該模型具有良好的擬合度，能真實地描述各因素與響應值之間的關系，可對山地五月茶黃酮的提取條件進行預測和分析［14］。

2.2.2.2 各因素響應面交互作用分析

將2 個因素固定在0 水平，通過Design-Ex-pert 8.06 軟件統計分析，觀察其余2 個因素的交互作用。通過響應面和等高線圖，分析各影響因素的響應面交互作用。由圖6-a可知，響應面坡度都比較陡峭，說明料液比（A）和乙醇濃度（B）對黃酮提取率影響較大［8］。由響應面的等高線圖（圖6-b）可知，等高線為橢圓形，說明料液比和乙醇濃度這2個自變量間交互作用較強。通過軟件分析得知，山地五月茶總黃酮的最佳提取條件為：乙醇濃度57.38%、料液比1∶39.58、提取溫度84.15℃，加熱回流提取101.13 min，在此條件下，預期山地五月茶黃酮得率可達到0.121 0。為實際操作方便，實際的最優提取條件為乙醇濃度57%、料液比1∶39、提取溫度84℃，加熱回流提取100 min，進行3 次重復實驗，山地五月茶總黃酮得率平均值為（0.118 9±0.02），與預測值接近，說明此響應面法得到的回歸模型具有一定的可靠性。

表4 方差分析

4 結論

本實驗研究了山地五月茶黃酮的提取工藝，通過單因素試驗和響應面分析法確定了山地五月茶黃酮的最佳提取條件為：乙醇濃度57%、料液比1∶39、提取溫度84℃、加熱回流提取100 min，黃酮得率為（0.118 9±0.02）。

圖6 乙醇濃度和料液比交互作用對黃酮得率影響的響應曲面圖和等高線圖

此提取工藝操作簡便、工藝成熟、提取率高、綠色環保，將為山地五月茶的研究開發提供實驗依據。