8種殺菌劑對9種薄殼山核桃炭疽病病原菌的毒力測定

孟 珂，張亞波，常 君，李志紅，王 迪，翟鳳艷＊，舒金平

(1.河南科技學院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400)

炭疽菌（Colletotrichumspp.）是一類重要的植物病原真菌，分布廣泛，在熱帶和亞熱帶地區(qū)尤為突出[1]。炭疽菌可侵染植物葉、花、果、莖及嫩枝等，引發(fā)各種植物炭疽病，造成葉斑、葉枯、花腐、果腐和枝枯等癥狀，嚴重時導致落葉、落花和落果，甚至植株死亡，給農林業(yè)生產造成極大損失，被稱為世界第八大植物致病真菌群[2]。

薄殼山核桃（Carya illinoinensis(Wangenh.) K.Koch）又名美國山核桃、長山核桃，原產于美國與墨西哥北部，是重要的木本油料樹種[3-5]。薄殼山核桃種仁油脂含量達65%以上，其中，不飽和脂肪酸含量90%以上，其果實是世界著名干果之一[6]。近年來，隨著我國南方薄殼山核桃種植面積的不斷擴大，病蟲害發(fā)生日益嚴重[7-8]，在浙江、江西和云南等薄殼山核桃主栽區(qū)爆發(fā)黑斑病，落葉、落果現(xiàn)象嚴重，造成重大的經濟損失。研究發(fā)現(xiàn)，炭疽菌是引發(fā)薄殼山核桃黑斑病的關鍵病原菌。由于該病具有潛伏期長、發(fā)病時間集中、爆發(fā)性強等特點，選擇高效、低毒的化學藥劑進行防治是一種有效策略。

國內外學者針對炭疽菌的藥效試驗開展了大量研究，篩選出了一系列高效藥劑，但不同種或同種菌不同菌株對殺菌劑存在著一定的特異性[9]，如戊唑醇對柿樹炭疽菌（C.gloeosporioides(Penz.)Penz.and Sacc）具有較好的抑制作用[10]，而對辣椒炭疽菌（C.gloeosporioides(Penz.) Penz.and Sacc）抑制作用較差[11]。作者從不同地區(qū)的薄殼山核桃病葉和病果中，分離到26 株炭疽菌，通過形態(tài)學特征和多基因序列分析共鑒定出9 種炭疽菌。先前應用于其它植物炭疽病防治的殺菌劑對薄殼山核桃炭疽病病菌的防治效果尚不清楚。因此，本研究利用菌絲生長速率法測定了8 種殺菌劑對9 種炭疽菌的室內毒力，以期篩選出高效低毒的殺菌劑，為薄殼山核桃炭疽病的防治提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 供試的9 種引起薄殼山核桃炭疽病的炭疽菌菌株分別收集自浙江、江西、安徽及云南4 地薄殼山核桃感病的葉片和果實（圖1），經分離純化后于PDA 斜面培養(yǎng)，4℃保存?zhèn)溆谩＞N/株的詳細信息見表1。

圖1 薄殼山核桃黑斑病癥狀Fig.1 Symptoms of black-spot disease of pecan

1.1.2 供試藥劑 供試藥劑原藥均由丙酮溶解，分別配制成10 mg·L-1的藥劑母液，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩９┰囁巹┘霸囼灊舛忍荻纫姳?。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯瓊脂糖（PDA）培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂16 g 蒸餾水1 000 mL。

1.2 實驗方法

采用菌絲生長速率法[10]測定8 種殺菌劑對炭疽病菌的毒力。按試驗濃度梯度配置含藥劑的PDA 培養(yǎng)基。將病原菌于PDA 培養(yǎng)基上，25℃下預培養(yǎng)5 d 后，在靠近菌落邊緣打取直徑5 mm 的菌餅，接種于含藥PDA 培養(yǎng)基上，每個處理放置1 個菌餅，設置3 個重復，于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d 后，采用十字交叉法測量每個菌落的直徑，計算抑制率（抑制率=((對照組菌落直徑-藥劑組直徑菌落直徑)/對照組直徑)×100%)。基于抑制率構建回歸方程，并計算抑制中濃度(EC50)。各處理均以丙酮為對照(CK)，每處理重復3 次。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用DPSV14.10 軟件構建各藥劑對不同菌種/株的毒力回歸方程（95%的置信限），并計算EC50值。利用SPSS 19.0 軟件，采用單因素方差分析（One-way ANOVA，LSD）進行不同藥劑EC50值差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同殺菌劑對C.fioriniae 的毒力測定

建立8 種藥劑對C.fioriniae6 個菌株的毒力回歸方程，并計算出各藥劑對C.fioriniae及各菌株的抑制中濃度，結果（表3）表明：8 種殺菌劑對C.fioriniae菌絲生長的抑制作用差異顯著(F(7,40)=12.507，P<0.001）；咯菌腈、咪鮮胺、戊唑醇和惡醚唑的抑制作用最強，平均EC50值分別是0.13、0.15、0.58、0.64 mg·L?1；其次甲基硫菌靈、吡唑醚菌酯及嘧菌酯，平均EC50值分別是4.39、5.50、7.88 mg·L?1；代森錳鋅的抑制效果最差，平均EC50值僅為43.40 mg·L?1。同一殺菌劑對同一菌種不同菌株菌絲生長的毒力也存在著差異。戊唑醇對供試的6 個菌株菌絲生長抑制作用差異最大，其對JD179 菌株的毒力(EC50=2.46)是JD756菌株(EC50=0.04)的61.5 倍；其次，吡唑醚菌酯和咯菌腈2 種藥劑對不同菌株毒力最大差異倍數(shù)分別是55.5 倍和27.0 倍；甲基硫菌靈、惡醚唑、咪鮮胺、嘧菌酯對6 個菌株的毒力差異變化相對小，最大差異倍數(shù)僅為1.61～3.83 倍（表3）。

2.2 不同殺菌劑對C.fructicola 的毒力測定

8 種殺菌劑對C.fructicola菌絲生長的抑制作用差異顯著（F（7,56）=7.320，P<0.001）（表4）。咯菌腈和咪鮮胺的抑制作用最強，平均EC50值分別為0.11、0.13 m·L?1；對菌株JX073 的抑制效果較好的殺菌劑有吡唑醚菌酯（EC50=0.01 mg·L?1）、甲基硫菌靈（EC50=0.14 mg·L?1）、咯菌腈（EC50=0.39 mg·L?1）、代森錳鋅（EC50=0.45 mg·L?1）、咪鮮胺（EC50=0.61 mg·L?1）；戊唑醇對菌株JX0731（EC50=0.53 mg·L?1）抑制效果較好。

2.3 不同殺菌劑對C.nymphaeae 的毒力測定

8 種殺菌劑對C.nymphaeae菌絲生長的抑制作用存在顯著差異（F（7,24）=5.35，P=0.001）（表5）。咪鮮胺、咯菌腈和惡醚唑對菌絲生長抑制作用最好；其次為嘧菌酯、戊唑醇、甲基硫菌靈、吡唑醚菌酯；代森錳鋅抑制作用最差。同一殺菌劑對不同菌株菌絲生長的毒力也存在著差異。戊唑醇的EC50值變異最大，對JD043 菌株的EC50值是JD3 的326.67 倍；其次，吡唑醚菌酯、嘧菌酯和惡醚唑的毒力差異倍數(shù)分別是14.36、11.30、11.17 倍；咪鮮胺、咯菌腈、代森錳鋅及甲基硫菌靈對4 個供試菌株的毒力差異相對穩(wěn)定，毒力差異倍數(shù)為2.33～4.61 倍。

表1 供試菌株Table 1 Information of strains for test

表2 供試藥劑及濃度Table 2 Fungicides and their concentration for tests

表3 不同殺菌劑對C.fioriniae 不同菌株菌絲生長的毒力測定Table 3 Toxicity test of different fungicides against mycelial growth of C.fioriniae

續(xù)表 3

表4 不同殺菌劑對C.fructicola 不同菌株菌絲生長的毒力測定Table 4 Toxicity test of different fungicides against mycelial growth of C.fructicola

2.4 不同殺菌劑對C.siamense 的毒力測定

8 種殺菌劑對C.siamense菌絲生長的抑制作用差異顯著（F（7,8）=22.553，P<0.001）（表6）。咯菌腈、咪鮮胺的毒力較高，代森錳鋅的抑制作用最差；吡唑醚菌酯、惡醚唑、甲基硫菌靈和戊唑醇對JX23 菌株的抑制作用高于CZ622 菌株，戊唑醇對2 個菌株的毒力變異最大，對CZ622 菌株的EC50值是JX23 菌株的14.34 倍。

2.5 不同殺菌劑對C.alienum 的毒力測定

8 種殺菌劑對C.alienum菌絲生長的抑制作用差異顯著（F（7,8）=18.45，P<0.002）（表7）。咯菌腈、咪鮮胺及惡醚唑的抑制作用相對較好，平均EC50值分別為0.09、0.14、0.90 mg·L?1。其次是嘧菌酯、甲基硫菌靈及吡唑醚菌酯3 種藥劑。同一殺菌劑對不同菌株的菌絲生長抑制作用也具有差異，戊唑醇對供試菌株抑制差異最大，最高EC50值是最低值的215.69 倍；咪鮮胺、惡醚唑毒力差異倍數(shù)分別是3.00、2.98 倍；甲基硫菌靈、代森錳鋅、吡唑醚菌酯、咯菌腈、嘧菌酯對2 個供試菌株的毒力差異倍數(shù)最小，為1.34～1.79 倍。

表5 不同殺菌劑對C.nymphaeae 不同菌株菌絲生長的毒力測定Table 5 Toxicity test of different fungicides against mycelial growth of C.nymphaeae

2.6 不同殺菌劑對C.tamarilloi 的毒力測定

8 種殺菌劑對C.tamarilloi菌絲生長的具有一定的抑制作用（表8），其中，咯菌腈、咪鮮胺和戊唑醇對C.tamarilloi菌株的抑制作用較好，EC50值小于1.00；而代森錳鋅的對C.tamarilloi菌株的抑制作用較差（EC50=71.63）。

表6 不同殺菌劑對C.siamense 不同菌株菌絲生長的毒力測定Table 6 Toxicity test of different fungicides against mycelial growth of C.siamense

2.7 不同殺菌劑對C.americae-borealis 的毒力測定

8 種殺菌劑對C.americae-borealis菌絲生長的抑制作用有明顯差異（表9）。咪鮮胺、咯菌腈及戊唑醇對供試菌株菌絲生長有較強的抑制作用，EC50值為0.01～0.48 mg·L?1；代森錳鋅EC50值為47.10 mg·L?1，對C.americae-borealis的毒力相對較差。

2.8 不同殺菌劑對C.coelogynes 的毒力測定

8 種殺菌劑對C.coelogynes菌絲的生長均存在抑制作用（表10），其中，咪鮮胺對菌絲生長抑制效果佳，EC50值為0.10 mg·L?1；代森錳鋅和戊唑醇對菌絲生長的抑制作用較差，平均EC50值為33.29 和62.40 mg·L?1。

2.9 不同殺菌劑對C.liaoningense 的毒力測定

8 種殺菌劑對C.liaoningens菌絲的生長均表現(xiàn)出一定的抑制作用（表11）。8 種殺菌劑中，咪鮮胺（EC50=0.13 mg·L?1）、咯菌腈（EC50=0.24 mg·L?1）及戊唑醇（EC50=0.48 mg·L?1）EC50值均小于1.00，抑制效果較好。

2.10 不同殺菌劑對供試26 株炭疽菌的毒力

將8 種殺菌劑對26 株炭疽菌的毒力進行了總體分析，結果（圖2）表明：8 種殺菌劑對供試菌株的毒力不同，其中，咪鮮胺和咯菌腈2 種藥劑對所篩選的9 種炭疽菌、26 個菌株的菌絲生長抑制作用最強，EC50值為0.01～0.28 mg·L?1，平均EC50值分別為0.14 和0.15 mg·L?1；其次為惡醚唑，EC50值為0.51～2.08 mg·L?1，平均EC50值為1.08 mg·L?1；再次為甲基硫菌靈、吡唑醚菌酯和嘧菌酯，EC50值為0.24～22.12 mg·L?1，平均EC50值分別為4.13、6.12、6.94 mg·L?1；代森錳鋅對26株炭疽菌菌絲抑制作用差異較大，EC50值均在17.23 mg·L?1以上，其中，3 株炭疽菌EC50值超過100.00 mg·L?1。

3 討論

本研究采用菌絲生長速率法，測定了8 種殺菌劑對9 種炭疽菌、26 個菌株的室內毒力，結果表明：咪鮮胺和咯菌腈對26 株炭疽菌均具有較高的生長抑制作用，且菌株對其均較敏感，其次為惡醚唑和甲基硫菌靈。

表7 不同殺菌劑對C.alienum 不同菌株菌絲生長的毒力測定Table 7 Toxicity test of different fungicides against mycelial growth of C.alienum

表8 不同殺菌劑對C.tamarilloi 同一菌株菌絲生長的毒力測定Table 8 Toxicity test of different fungicides against mycelial growth of C.tamarilloi

表9 不同殺菌劑對C.americae-borealis 同一菌株菌絲生長的毒力測定Table 9 Toxicity test of different fungicides against mycelial growth of C.americae-borealis

表10 不同殺菌劑對C.coelogynes 同一菌株菌絲生長的毒力測定Table 10 Toxicity test of different fungicides against mycelial growth of C.coelogynes

表11 不同殺菌劑對C.liaoningense 同一菌株菌絲生長的毒力測定Table 11 Toxicity test of different fungicides against mycelial growth of C.liaoningense

圖2 8 種殺菌劑對26 株炭疽菌的毒力Fig.2 Virulence of 8 fungicides for 26 strains of Collelotrichum spp.

炭疽菌屬（ColletotrichumCda.）是一個復雜的屬，包括多個致病種，且部分種致病力極強，給農業(yè)生產帶來巨大損失[1,12]。大量研究表明，不同炭疽菌種/菌株對殺菌劑的敏感性存在顯著差異[13-15]。劉霞等[15]研究表明，咪鮮胺和戊唑醇對4 株膠孢炭疽菌（C.gloeosporioidesPenz.）菌絲生長的抑制作用較高，甲基硫菌靈和代森錳鋅對4 株膠孢炭疽菌菌絲抑制效果差異顯著。高楊楊等[11]研究認為，吡唑醚菌酯、咯菌腈對尖孢炭疽菌（C.acutatumSimmonds）的菌絲生長和孢子萌發(fā)均具有很高的抑制效果。陳圓等[16]研究認為，25%吡唑醚菌酯乳油、50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑和430 g·L?1戊唑醇懸浮劑對火龍果（Hylocereus polyrhizusWebb.Britton &Rose）膠孢炭疽菌的抑制效果較好。也有研究表明，甲基硫菌靈、代森錳鋅和咪鮮胺等常用殺菌劑對炭疽菌引起的辣椒炭疽病的田間防治效果差[17]；炭疽菌對甲基硫菌靈等苯并咪唑類藥劑具有較強的耐受力[18-19]。本研究結果表明，所選用的8 種藥劑（6 類）對9 種炭疽菌的菌絲生長抑制效果顯著不同，且同一藥劑對同種炭疽菌的毒力因菌株的不同呈現(xiàn)出明顯差異；所篩選的咪鮮胺和咯菌腈適用性最廣，對9 種炭疽菌、26 個菌株均具有較高的生長抑制作用，其次為惡醚唑和甲基硫菌靈；但代森錳鋅對9 種炭疽菌、26 個菌株的抑制作用不明顯。

研究表明，同一藥劑的反復施用易迫使病蟲產生抗藥性[20-21]。李河等[22-23]發(fā)現(xiàn)，我國油茶（Camellia oleiferaAbel.）苗圃炭疽病菌已對多菌靈、乙霉威和戊唑醇產生嚴重的抗藥性。本研究結果表明，戊唑醇和代森錳鋅對26 個菌株的EC50值差異較大，分布在0.04～100.00 mg·L?1，吡唑醚菌酯和嘧菌酯次之，EC50值分布在0.24～22.12 mg·L?1之間，說明個別菌株對以上4 種藥劑敏感性可能降低；同時還發(fā)現(xiàn)，來自不同地理位置的菌株對不同殺菌劑的敏感性不同。浙江建德和浙江金華的菌株，對咪鮮胺、咯菌腈和戊唑醇較敏感；來自云南玉溪的菌株對咪鮮胺、咯菌腈、惡醚唑和甲基硫菌靈較敏感，安徽滁州的菌株對咪鮮胺、咯菌腈、惡醚唑和嘧菌酯較敏感；江西吉安的菌株對咪鮮胺、咯菌腈、吡唑醚菌酯和甲基硫菌靈較敏感。建議在生產中因時因地合理選擇殺菌劑防治薄殼山核桃黑斑病。

4 結論

由炭疽菌引起的薄殼山核桃炭疽病是目前危害薄殼山核桃的主要病害。本研究表明，咪鮮胺和咯菌腈抑制薄殼山核桃炭疽菌適用性最廣，效果最佳，其次為惡醚唑和甲基硫菌靈，4 種殺菌劑為防治薄殼山核桃炭疽病的有效藥劑。為避免產生抗藥性，建議在生產中輪換使用咪鮮胺、咯菌腈、惡醚唑和甲基硫菌靈等殺菌劑。