MC1-R在人病理性瘢痕組織中的表達及臨床意義＊

劉毅 蔡瓊珠 吳小雅 楊習端 陳超明 黃華森

病理性瘢痕又稱異常瘢痕，包括增生性瘢痕（HS）和瘢痕疙瘩（K），其形成機制尚未明確。作為整形外科的世界性難題，病理性瘢痕的形成一直困擾著整形外科醫生，而臨床上也未有行之有效的治療措施[1-2]。因此，研究病理性瘢痕形成的機制，為治療尋找新干預靶點，是該領域需要解決的關鍵問題。在20世紀七八十年代，Ouyang等[3]、Madu等[4]就注意到有色人種在垂體功能亢進、青春期及妊娠期等皮膚色素易沉著時期較易形成病理性瘢痕，而白化病患者則完全不形成病理性瘢痕。因此，多年來人們推測病理性瘢痕的形成與皮膚色素沉著有著某種內在聯系，但對此并未進行深入的研究。皮膚顏色的差異是由優黑素和褐黑素的比例所決定，而優黑素與褐黑素的比例是由黑色素皮質素受體1（melanocortin receptor l，MC1-R）所調控[5]。因此，MC1-R表達是此類研究的一個重要方向。本研究以病理性瘢痕患者為研究對象，通過免疫組化檢測病理性瘢痕和正常皮膚內MC1-R表達水平和定位情況，以期明確MC1-R與病理性瘢痕形成之間的關系，具體如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年9月-2019年10月于湛江中心人民醫院整形外科手術標本，包括增生性瘢痕15例，瘢痕疙瘩10例，以及另取來自術中棄用的正常皮膚樣本20例。正常皮膚樣本取自體表多個部位的術中棄用皮膚組織，取材部位包括顏面部、腰腹部；增生性瘢痕樣本所取瘢痕形狀呈不規則，高于正常皮膚且色紅質硬，局部伴瘙癢或痛覺過敏，取材部位包括四肢、面部、胸腹部。瘢痕疙瘩樣本所取瘢痕疙瘩呈蟹足狀、質堅硬，取材部位包括面部、腹部。排除標準：存在慢性皮膚病史、周圍神經病變，術前接受其他治療。三組性別、年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。所有樣本均來自醫院整形外科手術患者，組織樣本采集前均告知患者及其家屬試驗計劃和樣本去向，并簽署知情同意書。該研究經醫院倫理委員會批準同意。

表1 樣本來源信息

1.2 方法

1.2.1 材料處理 樣本于術中取下后，立即置入4% 多聚甲醛固定液中過夜，第2天進行常規梯度脫水、浸蠟和石蠟包埋。組織石蠟塊進行切片，以備免疫組化染色用途。

1.2.2 免疫組化染色與結果判定 將石蠟切片進行脫蠟和水化處理，進行酸性抗原修復10 min后，再次將切片于PBS中浸泡3次5 min/次；隨后，經阻斷內源性過氧化物酶活性10 min，將切片于PBS中浸泡3次，5 min/次。室溫下，采用10% BSA封閉液進行封閉非特異性抗原2 h，加抗MC1-R抗體（1∶100稀釋）于4 ℃濕盒過夜；次日滴加1∶200稀釋生物素化二抗，37 ℃恒溫孵育20 min。滴加1∶200稀釋鏈霉菌素抗生物素過氧化物酶復合物即三抗，37 ℃恒溫孵育20 min，各步驟之間均用緩沖液洗3次。采用AEC顯色后蘇木精復染。最后進行中性樹脂封片、鏡下觀察和拍照，每個組織切片隨機選取5個視野，計算每個視野的MC1-R陽性細胞百分比。MC1-R陽性信號呈黃色或棕黃色顆粒，MC1-R陽性細胞百分比=（MC1-R陽性細胞數/細胞總數）×100% 。所有切片均在同一臺顯微鏡下由同一研究人員拍攝。

1.3 統計學處理

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據處理，計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析；計數資料以率（% ）表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化結果MC1-R定位情況

三組樣本中進行MC1-R免疫組化檢測，評估MC1-R蛋白在正常皮膚組織、增生性瘢痕組織和瘢痕疙瘩組織中的表達水平和定位。MC1-R陽性信號呈黃色或棕黃色顆粒，其表達于表皮及真皮層。在正常皮膚中，MC1-R陽性表達多位于表皮基底層和皮膚附屬器周圍；在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中，MC1-R陽性表達見于表皮的基底層和真皮層中成纖維細胞聚集處。

2.2 三組免疫組化結果MC1-R定量比較

正常皮膚組MC1-R陽性表達百分比為（53±10）% ，高于增生性瘢痕組的（45±7）% 和瘢痕疙瘩組的（32±9）% ，且增生性瘢痕組MC1-R陽性表達百分比高于瘢痕疙瘩組，差異均有統計學意義（F=3.007，P＜0.001）。

3 討論

病理性瘢痕較易發生于有色人種和皮膚色澤較深的人群，發生率與正常人之比為2∶1～19∶1[6]。當垂體功能亢進，青春期、妊娠期等皮膚色素沉著明顯時也較易發生。因此，多年來人們推測病理性瘢痕的形成與皮膚色素沉著有著某種內在聯系，但對此并未進行深入的研究。皮膚顏色的差異是由優黑素和褐黑素的比例所決定，而優黑素與褐黑素的比例是由MC1-R所調控。因此MC1-R表達數量的不同，導致了皮膚色澤的不同。MC1-R廣泛分布于皮膚細胞上[7]，在真皮成纖維細胞、微血管內皮細胞亦表現出較高的MC1-R抗原性[8-9]。它能介導所有由褪黑素（α、β、γ-MSH和腎上腺皮質激素）誘導皮膚細胞所產生的免疫、炎癥反應、細胞外基質沉積等多種效應[10]。而病理性瘢痕的形成與免疫反應，細胞外基質及真皮內微血管關系密切[11-12]，因此，采用免疫組織化學方法檢測病理性瘢痕組織，普通瘢痕組織及正常皮膚組織中MC1-R含量，并比較其差異，探討病理性瘢痕形成與皮膚顏色變化之間的關系，從而從另一角度推測出病理性瘢痕形成的機制，目前國內外學者的研究主要集中在膠原代謝，細胞因子等領域[13-14]，對MC1-R在病理性瘢痕組織中的表達等研究報道尚少。

因此，本研究設計之初推測病理性瘢痕的形成與黑色素細胞的活動，尤其是調節色素沉著的MC1-R，存在著某種內在的聯系。然而，采用免疫組化法檢測病理性瘢痕（包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩）和正常皮膚組織內MC1-R含量的變化，對其進行比較和分析，發現皮膚組織內表皮和真皮層成纖維細胞內MC1-R表達水平在瘢痕組表達明顯下降，MC1-R不足的成纖維細胞可能更有助于病理性瘢痕的形成。此結果趨勢與膚色色素沉著的推測不相符，而與Luo等[15]研究結果一致。Luo等對成纖維細胞和人瘢痕疙瘩組織內的MC1-R表達進行評估，并驗證了激活的a-黑素細胞刺激激素的（aMSH）/MC1R信號通路對皮膚炎癥、纖維化反應和色素沉著存在拮抗作用。

本研究基于免疫組化技術，通過檢測人病理性瘢痕、正常皮膚組織中MC1-R含量的變化，對其進行比較和分析，從而揭示病理性瘢痕形成和MC1-R表達變化之間的內在關系，為病理性瘢痕的診治提供新靶標。然而，關于不同人種膚色之間病理性瘢痕形成與MC1-R表達的聯系尚未研究，仍需在未來的研究中進一步探明。