新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)在三文魚食材中的活性

呂 琦劉明婭戚菲菲龔姝然周沙沙鮑琳琳

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所,北京協和醫學院比較醫學中心,國家衛生健康委員會人類疾病比較醫學重點實驗室,新發再發傳染病動物模型研究北京市重點實驗室,北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術研究中心,國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室,北京 100021)

目前,新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疫情全球流行,由于該病病原體新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)傳染性強,傳播迅速,截至2020 年9 月全球累計確診人數超過2500 萬例,死亡人數超過85 萬,新型冠狀病毒肺炎對人類健康造成巨大威脅。SARSCoV-2 病毒主要通過飛沫傳播和密切接觸傳播[1-3],所以病毒在環境中的穩定性和在物體表面的活性直接影響了病毒傳播的效能,這些數據的掌握對制定有效的新冠病毒疫情控制措施極為重要。疫情爆發初始,以及國內疫情有效控制后,局部地區出現感染事件,似乎都圍繞著海鮮產品而發生,推測由于海鮮產品在包裝、運輸過程中,新冠病毒污染了裝運的外環境,并具有低溫冷藏環境下長時間存活的能力,這些條件的共存使得病毒容易向外傳播或擴散,導致到貨地區和人員的污染和感染。

為準確評估新冠病毒潛在風險及為疫情防控、病毒檢疫提供科學依據,本研究選擇海鮮產品三文魚,配制4% NaCl 仿海鹽水來簡單模擬海水主要成分(海水平均鹽度為35‰)[4]。將病毒滴加在三文魚表面和4%仿海鹽水中,分別放置在不同溫度條件,不同時間測定病毒滴度評估病毒在三文魚及仿海鹽水中的存活情況。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞

VeroE6 細胞,由中國醫學科學院醫學實驗動物研究所病原中心保存。

1.1.2 病毒株

SARS-CoV-2/WH-09/human/2020/CHN(GenBank:MT093631.2),由中國醫學科學院醫學實驗動物研究所、北京協和醫學院比較醫學中心分離。

1.2 主要試劑與儀器

三文魚塊:采購于食品生鮮超市;胎牛血清(Gibco,12109290CP);青/鏈霉素(Penicillin/Streptomycin) 雙抗生素溶液(Gibco,2076677);DMEM 培養基(Hyclone,AE29431646);0.25%Trypsin-EDTA(Gibco,2085264)。

生物安全柜(Thermo,1287,美國);二氧化碳細胞培養箱(Thermo,371,美國);-80℃超低溫冰箱(Thermo,905,美國);15 mL、50 mL 管離心機(SIGMA,6K15,美國);1 mL 管臺式離心機(KUBOTA,日本)。

1.3 實驗方法

1.3.1 病毒在三文魚表面活性的測定

實驗分設2 組,22℃組(室溫)和4℃組,每組各6 塊三文魚塊(長寬高為4 cm×4 cm×1 cm)。取100 μL 106.5TCID50/mL 病毒液加至各組受試魚塊表面,分別在22℃(室溫)和4℃放置0 h、1 d、2 d、3 d、4 d 和5 d 后,利用2 mL DMEM 培養基(100 U/mL 青霉素和100 μg/mL)反復沖洗三文魚表面3～5次,沖洗液離心收集上清液,測定滴度。實驗中除溫度外,環境濕度和風速基本一致,實驗重復3 次。

1.3.2 病毒在4%仿海鹽水中活性的測定

實驗分設為2 組。22℃組(室溫)和4℃組每組各8 管濃度為4% NaCl 滅菌鹽水做為仿海鹽水,每管0.9 mL。各取100 μL 105.33TCID50/mL 病毒液加至各組鹽水管中,分別在22℃(室溫)和4℃下存放0 h、1 d、2～5 d、7 d 和9 d 收集鹽水和病毒液混合液測定滴度。實驗中除溫度外,環境濕度和風速基本一致,實驗重復3 次。

1.3.3 病毒滴度測定

10 倍系列稀釋的病毒液接種于單層VeroE6 細胞中,37℃5% CO2孵育1 h 后,棄掉吸附液,加入200 μL 病毒培養基(DMEM 培養基中加入100 U/mL 青霉素,100 μg/mL 和2%胎牛血清),37℃,5%CO2孵育3 d,觀察細胞CPE,Reed and Muench 方法計算病毒組織細胞半數感染量(TCID50)[5]。

1.4 統計學方法

病毒滴度在不同組之間存在的差異運用GraphPad Prism 8.0 軟件進行ANOVA 單因素方差分析。P<0.05 時,認為兩者之間存在顯著性差異。

2 結果

2.1 病毒在三文魚表面活性的測定

將100 μL 106.5TCID50/mL 病毒液放置在三文魚塊表面,分別在22℃(室溫)和4℃條件下放置0 h、1 d、2 d、3 d、4 d 和5 d,收集三文魚表面病毒液,測定滴度。起始(0 h)收集病毒液,測定滴度為105.0TCID50/mL。三文魚放置在4℃時,在1 d、2 d、3 d 和4 d 均能測得病毒滴度,分別為104.17TCID50/mL、103.57TCID50/mL、103.11TCID50/mL 和 102.44TCID50/mL,病毒活力在1 d 內衰減超過50%,5 d 后病毒滴度低于檢測下限;放置在22℃(室溫)時,僅在1 d 測得病毒滴度,為102.67TCID50/mL,病毒活力在1 d 內衰減超過50%,2 d 后病毒滴度均低于檢測下限。見圖1、圖2。

2.2 病毒在4%仿海鹽水中活性的測定

圖1 在4℃和22℃條件下,不同時間三文魚表面病毒液滴度Figure 1 Virus titers on salmon surfaces at 4℃and 22℃in different times

圖2 在4℃和22℃條件下,三文魚表面病毒液與初始病毒液滴度比值Figure 2 Present virus titer/initial virus titer on salmon surfaces at 4℃and 22℃in different times

將100 μL 105.33TCID50/mL 病毒液放入4%仿海鹽水中,分別在22℃(室溫)和4℃放置0 h、1 d、2～5 d、7 d 和9 d,收集鹽水病毒混合液,測定病毒滴度。起始(0 h) 收集混合液,測定滴度為104.33TCID50/mL。4℃時,1～5 d 和7 d 均能測得病毒滴度,分別為103.89TCID50/mL、103.44TCID50/mL、103.28TCID50/mL、103TCID50/mL、102.67TCID50/mL 和102.17TCID50/mL,病毒活力在1 d 內衰減超過50%,9 d 后病毒滴度低于檢測下限;22℃(室溫)時,僅在1 d、2 d 測得病毒滴度,分別為102.78TCID50/mL 和102.44TCID50/mL,病毒活力在1 d 內衰減超過50%,3 d 后病毒滴度均低于檢測下限。見圖3、圖4。

3 討論

圖3 不同溫度條件下,不同時間4% NaCl仿海鹽水中病毒液滴度Figure 3 Virus titers in 4% NaCl imitation seawater at 4℃and 22℃in different times

圖4 不同溫度條件下,4% NaCl 仿海鹽水中病毒液與初始病毒液滴度比值Figure 4 Present virus titer/initial virus titer in 4% NaCl imitation seawater at 4℃and 22℃in different times

SARS-CoV-2 病毒主要通過飛沫傳播和密切接觸傳播[1-3],所以病毒在環境中的穩定性和在物體表面的活性直接影響了病毒傳播的效能。眾所周知,病毒通常在零度下易于長期存活,但在通常4℃或不同室溫條件下活性維持時間不得而知,而這樣的溫度,也是日常生活中三文魚等食材最常處于的溫度,研究調查病毒在這樣條件下的活力,對海鮮市場的病毒控制具有重要意義。

結果顯示4℃～22℃條件下,三文魚表面病毒可存活1～4 d,4% NaCl 仿海鹽水中病毒可存活2～7 d,從病毒滴度結果看出,SARS-CoV-2 在三文魚表面具有一定活性,因此被病毒污染的三文魚在解凍后低溫狀態具有較長時間活性;病毒在仿海水中也能穩定存活,所以伴隨運輸的海水如有污染,也會攜帶病毒,并具一定時間的活性。有研究對三文魚體內ACE2 進行分析,其結構異于人ACE2,所以無法與病毒S 蛋白結合,從而不能感染病毒[6],北京新發地三文魚案板上檢測到的病毒通過全基因組測序比對,發現病毒與歐洲流行株相似。所以推測三文魚在進口前就已被環境或者操作人員污染而粘附病毒。所以對進口食品的病毒檢疫、售賣環境的消毒和經手人員的預防都應該給予重視。

本文通過三文魚魚肉表面病毒活性的檢測獲得的結果,讓我們初步了解在三文魚表面病毒隨溫度的活性變化,掌握新冠病毒的一些生物特性,對我們進一步了解病毒和制定有效的防控策略提供有力的科學支撐。