線粒體動力相關蛋白1 與阿爾茨海默病

史 洺 邵思邁 余姊陽 原 野 張振強 張紫娟 郝 莉?

(1.河南中醫藥大學基礎醫學院,鄭州 450046;2.河南中醫藥大學中醫藥科學院,鄭州 450046)

線粒體在生物代謝和能量轉換中處于核心地位,參與調節細胞內自噬、鈣穩態、信號傳導和細胞凋亡等過程。細胞內線粒體呈動態變化的網狀結構,線粒體動力學在多種神經退行性疾病進程中至關重要。目前AD 發生的病理及分子機制尚不清楚,但迄今為止的研究表明,線粒體在其發病過程中占重要地位。

1 線粒體動力學及其功能

線粒體是細胞的“動力源”,通過氧化磷酸化產生細胞代謝所需能量。線粒體在胞質中融合、分裂、降解和再生的過程統稱為線粒體動力學。

分裂可以改變細胞中線粒體的形態,例如神經細胞中分布于胞體和樹突的線粒體較長,在軸突中則較為短小;分裂還可以切除不可修復的、功能失調的線粒體碎片,通過線粒體的自噬作用清除;在細胞凋亡過程中,線粒體分裂還能促進局部促凋亡細胞色素c 釋放到胞質[1]。線粒體融合通過線粒體DNA、蛋白質和脂質的相互補充確保了細胞器內容的均一性,并且可能由此拮抗過量活性氧(ROS)產生導致的線粒體DNA 損傷和功能障礙[2]。線粒體分裂和融合的平衡隨著各種生理信號和細胞內環境的變化而呈周期性改變。

2 線粒體動力相關蛋白1

哺乳動物細胞內,與動力有關的動力相關蛋白1 (dynamin-related protein1,Drp1 或 dynamin-like protein1,DLP1)在線粒體分裂中起關鍵作用。Drp1屬于發動蛋白超家族,最早被發現于酵母,稱為發動蛋白1(Dynamin1,DNM1),故又名DNM1L 蛋白。

目前研究認為,哺乳動物細胞中線粒體分裂和融合幾乎都只發生在內質網-線粒體接觸區[3]。線粒體分裂可分為三步:1)Drp1 蛋白從胞漿至線粒體外膜聚合;2)內質網和肌動蛋白共同驅動Drp1 蛋白收縮;3)Drp1 蛋白進一步收縮導致線粒體分裂。

線粒體分裂存在潛在復雜且嚴格的調節機制。Drp1 及其多種受體促進線粒體分裂,首先在預先標記的分裂位點周圍自組裝成螺旋狀聚合物,繼而寡聚化從而收縮ER 與線粒體接觸部位的膜,并產生切斷細胞器所需的收縮力[4]。但是,Drp1 如何通過受體被募集到線粒體表面的分子機制尚不清楚,最新研究發現,在線粒體與ER 接觸部位募集含有反式高爾基網絡的磷脂酰肌醇4-磷酸鹽的囊泡可能會觸發導致線粒體分裂的最終事件[5]。

2.1 Drp1 結構

完整的Drp1 分子結構主要包含以下結構域:N端的GTP 酶結構域、中間的螺旋形結構域、C 端的GTP 酶效應結構域(GED)以及B-Insert 區,功能區還包括三個束效應元件(BSE)與GTPase 結構域進行通信等。Drp1 本質上是一類GTP 水解酶,通過N端的GTP 酶結構域水解GTP 為線粒體提供分裂所需能量,而GED 和InsertB 區可以通過分子間的相互作用或化學修飾的方式影響Drp1 的活性從而影響其功能[6]。

通過對秀麗隱桿線蟲和哺乳動物細胞中的動力蛋白同源物的分析已鑒定出Drp1,并表明Drp1是進化上高度保守的分裂因子[7],使用Uniprot 數據庫對不同進化程度物種的基因比對分析同樣如此[8]。人類Drp1 突變引起相關疾病,例如中樞神經系統發育不全和神經退行性疾病,但突變體的所有位置在與膜分裂和細胞器分裂相關的發動蛋白相關蛋白家族的所有成員中是完全保守的[9]。因此,盡管Drp1 具有多種突變體,但所有的變異體都具有這些結構域,說明這是其發揮功能所必需的。

2.2 Drp1 的活性調控

不同生物功能的細胞有多種翻譯后水平機制調控Drp1 活性,如磷酸化、泛素化、SUMO 化、亞硝基化等。增加Drp1 GTP 水解活性會使構象變化,從而增加線粒體收縮和線粒體小管的斷裂緊密度。

2.2.1 Drp1 與磷酸化

Drp1 磷酸化與去磷酸化是激活和失活的過程。Drp1 的磷酸化可發生在不同的位點,包括Ser600 位點、Ser616 位點、Ser637 位點、Ser585 位點以及Ser693 位點等。

Ser600 包含在C 末端GTPase 效應器結構域的一致性CaMKI 磷酸化位點內。在神經元和HeLa 細胞中,在Ser600 處Drp1 的磷酸化與Drp1 向線粒體的易位增加有關,而在體外,Drp1 的磷酸化導致其對Fis1 的結合增加[7]。當Drp1 被Ser616 磷酸化的激酶激活時,會引起線粒體分裂[10-11],并參與線粒體鈣單向介導的中性粒細胞的極化和趨化作用[12]。例如,電離輻射可刺激Drp1 激活,引發線粒體分裂,但其觸發的是Ser616 處磷酸化,在Ser637 處未觸發[13]。Drp1 在Ser637 的GED 結構域內的磷酸化可以抑制GTP 酶的活性和線粒體的分裂[14-15]。從機制上講,GTPase 活性的這種變化可能是由于GTP結合或中間結構域與GED 結構域的相互作用減少所致。因此,Ser637 處的磷酸化導致Drp1 功能和線粒體形態明顯改變,可能參與細胞線粒體分裂的動態調節,但最近研究發現Drp1 中的Ser637 磷酸化狀態不是控制Drp1 募集到線粒體的決定因素[16]。此外,Drp1 在Ser585 位點的磷酸化促進有絲分裂細胞的線粒體分裂,外源表達未磷酸化突變體Drp1Ser585 有助于減少線粒體有絲分裂[17]。GSK3beta 通過634-690 殘基與Drp1 結合,并在GED 結構域中磷酸化Ser693,導致體外GTPase 活性降低,線粒體分裂減少,線粒體形態延長[18]。

Drp1 的單個磷酸化位點可以在體內調節線粒體的分裂和融合的進程,促進或抑制線粒體分裂,這些位點磷酸化的平衡調控著Drp1 的活性。盡管如此,Drp1 仍是目前研究公認的介導線粒體分裂的最關鍵蛋白。

2.2.2 Drp1 與泛素化

泛素化即通過泛素-蛋白酶體途徑降解底物,是生物體內蛋白質翻譯后調控的一個重要方式,在蛋白質定位、代謝、功能和降解方面起重要作用。

線粒體外膜存在E3 泛素化連接酶MARCH5(membrane-associated,RING-CH5),它可泛素化Drp1 并調節線粒體分裂。現有研究發現了有爭議的結果。首先,MARCH5 與Drp1 相互作用并導致其泛素化和蛋白酶體依賴性降解,從而抑制線粒體過度分裂[19-20]。Karbowski 的小組發現MARCH5 敲除選擇性地抑制Drp1 的線粒體受體MiD49 的泛素化和蛋白酶體降解,從而導致線粒體斷裂,支持MARCH5 是線粒體分裂的負調節因子的可能性[21]。但在其它研究中觀察到了MARCH5 在線粒體分裂中的相反作用,即其對Drp1 呈正向調節作用。研究人員發現MARCH5 突變和MARCH5 RNA 干擾可導致Drp1 在細胞內的分布和線粒體結合的異常,Drp1的異位表達反過來逆轉了MARCH5 Ring 突變體誘導的線粒體異常,提示MARCH5 與Drp1 具有很強的功能依賴性[22]。另一項研究中,PARK 等人發現MARCH5 蛋白低表達的細胞中,線粒體高度互連且拉長。由此,缺乏MARCH5 導致線粒體延伸,其通過阻斷Drp1 活性、促進線粒體中融合相關蛋白Mfn1 的積累來促進細胞衰老[23]。

哺乳動物細胞線粒體分裂需要MARCH5,它是OMM 上的E3 泛素連接酶,其C-末端結構域在MARCH5 底物的降解中起關鍵作用,可能是通過促進OMM 中泛素化蛋白的釋放[24]。MARCH5 對其底物尤其是Drp1 的調控可能存在一些特異性,與修飾位點、結構變化以及是否與Drp1 受體相互作用等有關,并且需要綜合考慮多種信號平臺的參與,包括細胞內特異性蛋白表達的變化以及與分裂相關分子活性的調節。

此外,Drp1 被APC/CCdh1(促進相位的復合物/環體及其輔激活物Cdh1)E3 泛素連接酶復合物泛素化時,這種在分裂周期由M 到G1 期轉變的調節因子,可調節細胞分裂時G1/S 期線粒體形態[25]。另一種E3 連接酶Parkin,在穩定狀態下主要定位于胞漿中,也誘導Drp1 的蛋白酶體降解[26],提示Parkin 以Drp1 為底物,在線粒體分裂中起抑制作用。

這些研究表明Drp1 泛素化修飾在線粒體分裂過程中有重要作用,但其具體作用機制仍需進一步研究。

2.2.3 Drp1 與SUMO 化

小泛素相關修飾物(smallubiquitinrelatedmodifier,SUMO)是一種類泛素分子,主要調節蛋白質的相互作用、細胞內定位和活性等。SUMO 和泛素修飾同一底物時,SUMO 化通常阻止底物被UPS 降解,有時兩種修飾方式也協同調節蛋白質功能,即二者既有拮抗作用,也有協同作用。

研究發現,DRP1 是MAPL(線粒體錨定蛋白連接酶)的底物,MAPL 同時具有泛素連接酶和SUMO連接酶活性,可以通過促進的Drp1SUMO 化顯著提高被募集到線粒體分裂位點上形成的復合體的穩定性,從而增強線粒體分裂[27-28]。SUMO 化的Drp1在功能上穩定了內質網和線粒體的接觸位點,這些位點與線粒體收縮,鈣離子通道,線粒體嵴重建和細胞色素c 釋放有關[29]。

2.2.4 Drp1 與亞硝基化

蛋白質巰基亞硝基化是指一氧化氮及其衍生物修飾蛋白質半胱氨酸巰基-SH 生成-SNO,這是一氧化氮發揮其廣泛信號轉導作用的重要途徑。

S-亞硝基谷胱甘肽還原酶(GSNOR)是一種重要的脫氨酰化酶,研究表明GSNOR 缺乏會促進線粒體亞硝基化應激,包括Drp1 和Parkin 的過度S-亞硝基化,從而損害線粒體動力學和線粒體[30]。在分子水平上,也有報道稱Drp1 在受到NO 的S-亞硝基化作用時可以呈活性形式,從而導致線粒體過度分裂并引起神經毒性[31]。MAP1B-LC1(亞硝化微管相關蛋白1B-輕鏈1)被鑒定為MARCH5 的結合蛋白,研究發現MARCH5 特異性識別并誘導S-亞硝基化修飾的MAP1B-LC1 的降解[32],這表明MARCH5 具有選擇性識別其底物并部分地通過降解活性Drp1 和MAP1B-LC1 來防止線粒體動力學失衡的作用。

蛋白質巰基亞硝基化對細胞生存的作用需要結合其在組織中的位置結構、功能水平和生理階段等綜合效應,但目前研究表明Drp1 亞硝基化對細胞的損害與多種神經退行性疾病相關。

3 Drp1 與AD

蛋白組學分析證明了退行性疾病與全身變化有關,其中包括線粒體功能障礙,能量減少和氧化應激等[5]。Drp1 廣泛分布于中樞神經系統,進一步的觀察表明,Drp1 在抑制性神經元中高度異質表達。在透射電鏡下,Drp1 在樹突中的分布高于神經元中的其他區域,并且只有少量的Drp1 位于線粒體中[33]。在應激狀態下,胞漿內的Drp1 以多種形式修飾后,活性發生改變,導致其聚集在線粒體外膜,進一步引起線粒體分裂。

3.1 Drp1 介導的線粒體分裂與AD

研究認為,Drp1 高表達引起的線粒體分裂增多及碎片化與AD 病理高度相關。研究人員從患有早老素1(PS1)突變患者的外周血中分離出單核細胞,其衍生的神經元中,融合相關蛋白Mfn1 顯著減少,而DRP1 增加[34]。AD 小鼠體內實驗證明,認知功能下降與Drp1 的過度活化相關[35]。

由于線粒體過度分裂與AD 等神經退行性疾病相關,因此調控線粒體分裂有望成為一種新的治療策略。但與期望結果不同,Drp1 敲低雖然減少了線粒體碎片化,但不能提高細胞生存能力或線粒體功能。因此,糾正線粒體形態或分布無法恢復其生物能效率,神經元仍無法恢復健康狀態[36]。

化合物Mdivi-1 是目前公認的Drp1 抑制劑,可直接減少線粒體片段化[37]。動物實驗證明,Mdivi-1 預處理可防止Drp1 依賴性的過度線粒體分裂,減輕神經細胞凋亡和突觸損傷,并改善長期認知功能[38]。而對Mdivi-1 作用機制的研究表明,慢病毒低表達Drp1 不能降低NMDA 誘導的線粒體分裂和毒性。因此Mdivi-1 對細胞的保護作用可能不依賴于Drp1,而主要通過調節線粒體功能和細胞內Ca2+信號傳導來防止NMDA 受體介導的興奮性毒性[39]。

雖然如此,但值得思考的是,抑制Drp1 的表達是否對挽救AD 病程起至關重要的作用。最近的研究表明,細胞損傷時,鈣離子流入和Drp1 介導的損傷部位線粒體快速分裂有助于極化修復反應。顯然,線粒體分裂會產生細胞存活所需的局部信號[40]。功能紊亂的線粒體積累與衰老有關,但線粒體分裂對衰老過程的影響需要更深入的研究。于果蠅體內的研究顯示上調Drp1 可促進線粒體分裂,延長果蠅壽命和健康期[41]。Drp1 通過mRNA 剪接可產生多種亞型,其中Drp1ABCD 亞型富含樹突棘,并且其作用獨立于線粒體分裂,調節突觸后網格蛋白介導的內吞作用、神經元形態和功能[42]。Drp1的外源表達降低了Aβ 轉基因果蠅大腦中的ATP 水平,并抑制了神經元變性,這是通過保護線粒體功能實現的,提示Drp1 可能是AD 的潛在治療策略[43]。

3.2 Drp1 與AD 病理產物

AD 的病因和發病機制尚未明確,目前有許多假說,包括線粒體功能障礙、β 淀粉樣斑塊沉積、tau蛋白學說、神經炎癥、氧化應激、自噬等,其中線粒體動力學改變尤其是Drp1 的表達與AD 病理產物相互影響逐漸備受關注。

AD 病理產物主要包括Aβ 沉積和異常磷酸化的tau 蛋白。Aβ-42通過靶向線粒體誘導神經元凋亡,包括促進線粒體分裂,破壞線粒體膜電位,增加細胞內ROS 水平和激活線粒體自噬過程等[44]。Drp1 是細胞周期蛋白依賴性激酶5(Cdk5)的直接靶標,并且Cdk5 介導的Drp1 在Ser579 的磷酸化,調節Aβ1-42誘導的線粒體分裂和神經元毒性[45]。Aβ 通過Akt 的持續磷酸化直接激活Drp1 并通過mTOR 途徑抑制自噬。這些變化共同引起大量線粒體斷裂,導致ROS 介導的神經細胞凋亡[46]。細胞實驗證明,反應性小膠質細胞中線粒體分裂和融合的多態性調節是由炎癥條件下的獨特信號介導的,并通過產生ROS 來調節小膠質細胞表型[47]。

tau 對肌動蛋白的穩定作用對于蛋白質的神經毒性至關重要,研究表明肌動蛋白介導的線粒體動力學破壞是體內神經元tau 毒性的直接機制[48]。而對AD 患者以及AD 轉基因小鼠的腦組織中的GTPase 活性檢測表明,線粒體分裂相關的GTP 酶活性顯著升高,其對于線粒體片段化至關重要。Drp1、Aβ 與異常磷酸化tau 相互作用可能加劇線粒體過度斷裂,線粒體功能異常和突觸缺乏,最終導致神經元損傷和認知能力下降[49]。

這種Drp1 參與的線粒體動力學改變和非局限于線粒體的病理改變,在AD 病程中起重要作用。因此針對抑制Drp1,Aβ 和tau 表達的治療可能會降低其相互作用,從而保護神經元免受過量Drp1,Aβ和異常磷酸化tau 的毒性傷害。

4 結語

Drp1 的表達與調控影響線粒體動力學平衡,異常的線粒體分裂導致線粒體從管狀形態碎片化,相反,線粒體的過度分裂導致相鄰線粒體融合。Drp1通過介導哺乳動物的線粒體分裂過程影響細胞存活和凋亡,其功能可能在很大程度上超出線粒體分裂。

因此,筆者認為Drp1 的表達與功能需結合環境因素、生物體的生理病理狀態、多種胞內信號轉導及作用途徑綜合研究。目前研究對Drp1 對線粒體分裂的作用尚不完全明確,不能單面評估其對細胞、疾病乃至整個生命體的作用。我們希望Drp1 與線粒體之間的關系可能對AD 的研究和臨床治療具有指導意義,但是在體內和體外闡明這種關鍵蛋白的調節機制后,它才能為治療線粒體分裂相關疾病樹立一個里程碑。