mi R-605-3p/TRIB3/β-catenin信號通路調控肺癌的發展

葉志堅 李敏菁 溫業良

佛山市第一人民醫院呼吸內科528000

肺癌是全球最常見的原發性惡性腫瘤，病死率和致殘率最高[1]。盡管近年來相關研究取得了長足的進步，但臨床效果仍不令人滿意，幾乎所有患者最終都將復發，從而強調了鑒定參與肺癌進展的新型生物分子和信號傳導的重要性[2]。微小RNA(micro RNA，mi RNA)是一類小的非編碼內源性RNA 分子，可以調節許多人類基因，并在多種疾病中起關鍵作用[3]。mi RNA 在肺癌中失調，并參與腫瘤的發生、發展和耐藥性[4]。Wang等[5]通過深度測序發現mi R-605-3p在肺癌中的表達量較低。mi R-605-3p通過上調EZH2抑制前列腺癌的惡性進展[6]。然而，mi R-605-3p 在肺癌中的作用尚未有人描述。基于此，本研究旨在探討mi R-605-3p是否影響肺癌細胞A549的增殖和細胞活力。

1 材料與方法

1.1 材料 Lipofecta mine 3000 購自廣州雙螺旋生物科技有限公司 (貨號：L3000015)。TRIB3、TUBULIN、β-Catenin、H3 抗體購自英國abcam公 司 (貨 號： ab50516、 ab7291、 ab2365、ab176842)。肺癌細胞A549 購自深圳市科普生物有限公司(貨號：IFO50153)。二辛可寧酸蛋白質測定試劑盒購自廣州朔博生物科技有限公司 (貨號：XB-K3000)。CCK-8 試劑盒購自北京友誼中聯生物科技有限公司 (貨號：P04D30X)。p mir-glo utr1質粒購自廣州基旦生物科技有限公司(貨 號：JD190929001 M)。mi R-605-3p 抑 制 劑、mi R-605-3p模擬物均由北京擎科合成。si TRIB3和siβ-catenin由吉凱基因合成。MTT 試劑盒購自廣 州 春 博 生 物 科 技 有 限 公 司 (貨 號：SLF-M1020)。RPMI-1640培養基購自北京華博德億生物技術有限公司 (貨號：SH30809.02B)。

TRIB3過表達質粒通過A549細胞的c DNA 克隆至p CDNA3.1表達載體上。胎牛血清購自廣州市齊云生物技術有限公司 (貨號：HQ30071)。RNA 小量提取試劑盒購自北京欣華綠源科技有限公司(貨號：R6834-00)。逆轉錄試劑盒購自昆明皇寶商貿有限公司 (貨號：218161)。2×SDS 蛋白電泳上樣緩沖液購自武漢潔洋盛科技有限公司 (貨號：M337-5 ML)。雙熒光素酶報告基因試劑盒購自武漢純度生物科技有限公司 (貨號：CDLG-4997)。熒光定量PCR 試劑盒購自上海兢蔚生物科技有限公司(貨號：BL705 A)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與轉染 非小細胞肺癌A549細胞生長于RPMI-1640培養基中，并在37 ℃，5%CO2的濕潤培養箱中培養。所有培養基均添加10%胎牛血清、100 ng/L鏈霉素和100 n U/L青霉素。將轉染試劑與mi R-605-3p抑制劑、mi R-605-3p模擬物、TRIB3質粒、si TRIB3和siβ-catenin混合并在室溫下孵育15 min后，緩緩滴入非小細胞肺癌A549 細胞中。轉染合成的mi R-605-3p模擬物過表達mi R-605-3p 為過表達組，轉染合成的mi R-605-3p抑制劑敲低mi R-605-3p為敲低組。

1.2.2 RNA 抽取與實時熒光定量PCR 根據說明書，經RNA 小量提取試劑盒提取的RNA，使用逆轉錄試劑盒逆轉錄為c DNA。使用熒光定量PCR 試劑盒進行實時熒光定量PCR。

1.2.3 免疫印跡法 使用RIPA 緩沖液從非小細胞肺癌A549 細胞中提取總細胞蛋白，12 000 r/min離心20 min (離心半徑為13.5 c m)，4 ℃收集上清液。使用二辛可寧酸蛋白質測定試劑盒測量這些蛋白質樣品的濃度。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠中分離蛋白質樣品 (每個泳道30μg)，然后轉移到硝酸纖維素膜上。用5%脫脂牛奶封閉后，將膜與所示第一抗體在4℃下孵育過夜。第二天，將膜與耦聯了辣根過氧化物酶的相應抗小鼠或抗兔Ig G 二抗在室溫下孵育1 h。蛋白質條帶使用Western Bright ECL 試劑盒，然后使用Che mi DocTMXRS+系統進行可視化。

1.2.4 熒光素酶報告實驗 將TRIB3的3'端非編碼的A 或T 分別做G 或C的突變，命名為突變型-TRIB3的3'端非編碼區。突變型和野生型均克隆進p mir-glo utr1質粒中。將A549細胞與上述質粒和TK Renilla報告基因 (8 ng)根據試劑盒說明，使用Lipof ecta mine 3000進行轉染。轉染48 h后，裂解總細胞蛋白，并使用雙重熒光素酶測定系統檢測熒光素酶活性(螢火蟲和海腎)。

1.2.5 CCK-8實驗 使用CCK-8試劑盒測定評估細胞增殖水平。簡而言之，將過表達組、敲低組、對照組中的A549 細胞于96 孔板中培養，并在37 ℃下孵育3 d。隨后，將在細胞培養基中1∶10稀釋的CCK-8染料加入到每個孔中，并在37 ℃下孵育2 h。使用設定在450 n m 的酶標儀讀取吸光度。450 n m 光密度值與活細胞總數成正比，并用于評估轉染細胞與對照轉染細胞的細胞活力。使用一式三份的孔并重復實驗至少3次。

1.2.6 MTT 實驗 使用MTT 法測定評估細胞活力。第一天用胰蛋白酶消化A549細胞，將A549細胞稀釋至75 000個細胞/ml(使用完全培養基稀釋細胞)，向96 孔板的每孔中加入100μl細胞(總共7 500個細胞)并孵育過夜；第二天處理細胞，且最終每孔體積為100μl；第三天，向每個孔中加入20μl MTT (5 g/L)，包括一組具有MTT但沒有細胞的孔 (對照)，在培養箱中37 ℃孵育3.5 h。小心取出96 孔板，加入150μl二甲基亞砜，用錫箔覆蓋并在軌道振蕩器上攪拌細胞15 min。在酶標儀中讀取490 n m 處的吸光度值。

1.3 統計學分析 使用SPSS 21.0或Graph Pad Pris m 5.0軟件對數據進行統計分析。所有定量結果均以x-±s表示，使用t檢驗比較組間差異。P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 mi R-605-3p抑制肺癌細胞A549的增殖和細胞活力 過表達組肺癌細胞A549的增殖水平和細胞活力較對照組均下降 (t=12.45、15.38，P 值均＜0.05)；敲低組肺癌細胞A549的增殖水平和細胞活力較對照組均上升 (t=11.54、8.45，P值均＜0.05)，見圖1、2。

圖1 過表達或敲低mi R-605-3p后肺癌細胞A549的增殖水平

圖2 過表達或敲低mi R-605-3p后肺癌細胞A549的細胞活力

2.2 mi R-605-3p靶向TRIB3 通過mi RDB 在線分 析，發 現 mi R-605-3p 潛 在 靶 向 AHCYL2、LSM12、 NEGR1、L HFPL2、 KIF3B、 TRIB3、PNKD、DAD1。敲低mi R-605-3p后，通過實時熒光定量PCR 發現TRIB3表達量升高 (t=5.710，P ＜0.05)；過表達mi R-605-3p 后，TRIB3 表達量降低 (t=6.34，P ＜0.05)；通過熒光素酶報告實驗，發現mi R-605-3p 靶向野生型和突變型TRIB3的3'端非編碼區比較，差異有統計學意義(t=8.256，P ＜0.05)，見圖3、4。

2.3 TRIB3促進肺癌細胞A549的增殖水平和細胞活力 過表達TRIB3 后，肺癌細胞A549 的增殖水平和細胞活力上升 (t=10.45、9.04，P 值均＜0.05)；敲低TRIB3后，肺癌細胞A549的增殖 水 平 和 細 胞 活 力 下 降(t=8.43、17.43，P 值均＜0.05)，見圖5。

圖3 過表達或敲低mi R-605-3p后mi R-605-3p潛在靶標的表達水平 A：AHCYL2；B：LSM12；C：NEGR1；D：LHFPL2；E：KIF3B；F：TRIB3；G：PNKD；H：DAD1

圖4 過表達mi R-605-3p后TRIB3 3'端非編碼區的熒光素酶活性

2.4 mi R-605-3p 激 活β-catenin 信 號 通 路 過 表達mi R-605-3p 后，TRIB3 的表達下降，β-catenin進入細胞核的量減少；敲低 mi R-605-3p 后，TRIB3的表達上升，β-catenin進入細胞核的量增加，見圖6。

2.5 mi R-605-3p/TRIB3/β-catenin通路調控肺癌細胞A549的增殖和細胞活力 同時敲低mi R-605-3p和TRIB3 或mi R-605-3p 和β-catenin，肺 癌 細 胞A549的增殖水平和細胞活力與對照組比較，差異均無統計學意義 (t =0.42、0.61，P 值均＞0.05)；過表達TRIB3的同時敲低β-catenin，肺癌細胞A549的增殖水平和細胞活力與對照組比較，差異均無統計學意義 (t=0.56、0.21，P 值均＞0.05)，見圖7。

3 討論

肺癌是全球癌癥死亡的主要原因[7]。在GLOBOCAN 2018 數據庫中，估計有209 萬例新病例和176萬例死于肺癌[8]。從組織學上講，肺癌可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌。后者占肺癌病例的80%以上，分為腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞癌。目前，肺癌的總體5年生存率仍然很低，僅為16.8%，而在轉移性疾病中，這一比例還不到5%[9]。

mi RNA 是小型非編碼RNA 的家族，它們可以通過與目標mRNA 的互補位點堿基配對來抑制mRNA 翻譯并促進mRNA 降解[10]。通過這種機制，mi RNA 在轉錄后可以改變基因表達。本研究發現，過表達mi R-605-3p 后，肺癌細胞A549 的增殖水平和細胞活力均下降 (P 值均＜0.05)；敲低mi R-605-3p后，肺癌細胞A549 的增殖水平和細胞活力均上升 (P 值均＜0.05)。通過mi RDB在線分析，發現mi R-605-3p 潛在靶向AHCYL2、LSM12、 NEGR1、L HFPL2、 KIF3B、 TRIB3、PNKD、DAD1。過表達或敲低mi R-605-3p后，通過實時熒光定量PCR發現mi R-605-3p引起TRIB3表達量的變化；通過熒光素酶報告實驗，發現mi R-605-3p靶向TRIB3的3'端非編碼區。盡管本研究僅發現mi R-605-3p 靶向TRIB3，但是單個mi RNA 可能具有許多靶標mRNA。因此，mi R-605-3p可能存在多個底物，而這些底物是否能夠調控肺癌的發展仍然值得進一步研究。

圖5 TRIB3過表達或敲低后肺癌細胞A549的增殖水平和細胞活力 A：過表達TRIB3后肺癌細胞A549的增殖水平；B：過表達TRIB3后肺癌細胞A549的細胞活力；C：敲低TRIB3后肺癌細胞A549的增殖水平；D：敲低TRIB3后肺癌細胞A549的細胞活力

圖6 免疫印跡法檢測過表達或敲低mi R-605-3p對β-catenin定位的影響 A：過表達mi R-605-3p后β-catenin在細胞質中的定位；B：過表達mi R-605-3p后β-catenin在細胞核中的定位；C：敲低mi R-605-3p后β-catenin在細胞質中的定位；D：敲低mi R-605-3p后β-catenin在細胞核中的定位

圖7 mi R-605-3p/TRIB3/β-catenin通路調控肺癌細胞A549的增殖和細胞活力 A：同時敲低mi R-605-3p和TRIB3或mi R-605-3p和β-catenin后肺癌細胞A549的增殖水平；B：同時敲低mi R-605-3p和TRIB3或mi R-605-3p和β-catenin后肺癌細胞A549的細胞活力；C：過表達TRIB3的同時敲低β-catenin后肺癌細胞A549的增殖水平；D：過表達TRIB3的同時敲低β-catenin后肺癌細胞A549的細胞活力

TRIB3是內質網應激的新誘導劑，參與細胞死亡和再生[11]。本研究發現過表達TRIB3后，肺癌細胞A549 的增殖水平和細胞活力上升 (P 值均＜0.05)；敲低TRIB3后，肺癌細胞A549的增殖水平和細胞活力下降 (P 值均＜0.05)。最近的研究表明，TRIB3在多種腫瘤中均是一種癌蛋白。例如，TRIB3與晚期腫瘤階段和腎細胞癌的不良預后均呈正相關，并促進腎細胞癌細胞增殖、遷移和侵襲[12-14]。在細胞中，幾個mi RNA 可以結合并調節同一靶標。因此，在其他癌癥中TRIB3可能受除mi R-605-3p外的其他mi RNA 調節，最終促進了相關癌癥的發展。

Wnt/β-catenin信號傳導是促成腫瘤進展的最重要途徑[15]。同時，Wnt/β-catenin信號在肺癌中被激活，大多數肺癌病例在該信號的關鍵成分中均存在基因突變[16]。Zhang等[17]發現TRIB3能夠激活β-catenin 信號通路。本研究發現過表達mi R-605-3p后，TRIB3 的表達下降，β-catenin 進入細胞核的量減少；敲低mi R-605-3p 后，TRIB3的表達上升，β-catenin 進入細胞核的量增加。同時 敲 低mi R-605-3p 和TRIB3 或mi R-605-3p 和β-catenin，發現肺癌細胞A549的增殖水平和細胞活力差異無統計學意義 (t=0.42、0.61，P 值均＞0.05)。過表達TRIB3的同時敲低β-catenin，發現肺癌細胞A549的增殖水平和細胞活力差異無統計學意義 (t=0.56、0.21，P 值均＞0.05)。Wnt/β-catenin信號級聯反應已成為肺癌治療的有希望的靶標。但是，針對Wnt/β-catenin信號傳導的策略尚未應用于臨床試驗或對肺癌的治療效果有限，這暗示著在肺癌中還有其他一些關鍵的調控因子。例如，C 末端結合蛋白2 通過抑制Wnt/βcatenin信號傳導促進非小細胞肺癌細胞增殖并降低對順二氨二氯鉑的敏感性[18]。此外，使用sox30基因敲除小鼠，sox30通過直接轉錄抑制β-catenin或與β-catenin相互作用，同TCF 競爭與β-catenin的結合來抑制肺癌的轉移[19]。因此，TRIB3可以促進肺癌治療的發展，從而充分揭示導致Wnt/β-catenin信號傳導的潛在機制。

綜上所述，mi R-605-3p 靶向TRIB3 抑制β-catenin的入核水平，隨后抑制了肺癌細胞A549的增殖水平和細胞活力。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突