非小細胞肺癌患者癌組織中長鏈非編碼RNA LINC01614表達及臨床意義

姜鑫 李國奇 吳登斌

1鞍鋼集團總醫院呼吸與危重癥醫學科，鞍山150000；2鞍鋼集團總醫院腫瘤科，鞍山150000

肺癌是全球癌癥死亡的主要原因，主要由腺癌和鱗狀細胞癌組成的非小細胞肺癌 (non-s mall cell l ung cancer，NSCLC)是肺癌的主要形式，約占所有肺癌的80%[1]。盡管NSCLC的治療取得了新的進展，但NSCLC的預后仍然不理想，其5年總生存率(overall sur vival，OS)為15.9%[2]。因此，深入研究NSCLC發生、發展的機制對于改善該病的診斷、治療和預后至關重要。基因組學研究發現，人類基因組中只有一小部分 (＜2%)能夠編碼蛋白質，而其余部分則由許多非編碼RNA 組成。越來越多的證據表明非編碼RNA 可能參與了腫瘤的發病機制，這為腫瘤的生物學研究提供了新的視角[3]。長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA，l nc RNA)是一類長度超過200核苷酸的不編碼蛋白質的RNA，在許多癌癥中異常表達，與腫瘤的發生、增殖和侵襲有關，可作為早期診斷、治療和預后的重要指標[4]。近年來的研究證實了l nc RNA 在結直腸癌、胃癌、肝癌等腫瘤中的生物學功能[5-7]。然而，lnc RNA 在NSCLC進展中的作用仍然不清楚。本研究通過微陣列分析表征了NSCLC中l nc RNA 的表達譜，并鑒定了表達最異常的l nc RNA LINC01614，初步探討NSCLC 患者癌組織中LINC01614表達及臨床意義，為NSCLC患者預后評估提供科學依據。

1 對象與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2017年12月期間在鞍鋼集團總醫院行手術切除的75例原發性NSCLC患者癌組織作為病例，并選取相對應癌旁組織(距腫瘤邊緣＞5 c m)作為對照。其中男42例，女33例；年齡 (58.89±10.16)歲，年齡范圍為38～80歲。收集所有患者的性別、年齡、吸煙史、病理類型及腫瘤長徑等臨床基本資料進行回顧性研究，NSCLC 患者出院后均進行隨訪，隨訪資料完整。手術后樣本組織立刻放置在液氮中進行保存。納入標準：(1)所有患者經組織病理學或細胞學診斷明確，符合原發性肺癌診療規范標準[8]；(2)在鞍鋼集團總醫院進行首程治療，未接受放療、化療及免疫治療；(3)有完整的臨床病歷或體檢資料，無其他遺傳?。?(4)治療期間無死亡病例，患者均已出院。排除標準：(1)合并其他類型的腫瘤；(2)近3個月內應用過抗生素；(3)合并其他結締組織、內分泌和代謝疾病； (4)有嚴重心、肝、腎及精神病史或精神病家族史。采用美國國立綜合癌癥網絡 (2011)的NSCLC 標準進行TNM 分期，收集所有患者的臨床資料。本研究符合《赫爾辛基宣言》的原則，所有研究對象對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2 l nc RNA 微陣列分析 取出保存的組織標本，研碎，加入1 ml TRIzol(美國Life Technologies公司)進行提取RNA，根據Taq Man micro RNA反轉錄試劑盒 (美國ABI公司)說明合成c DNA。按照入組順序進行編號，應用Excel隨機數生成器，生成8個隨機數，選取隨機數對應編號的8例癌組織和相應癌旁組織進行mi R 微陣列分析。將c DNA 進行pol y A 加尾Mix 和進行生物素標記，然后雜交到芯片上。采用安捷倫微陣列分析平臺，即人l nc RNA 陣列V3.0，保護30586 l nc RNA 的探針。實驗Agilent芯片掃描儀對芯片進行掃描，用Agilent GeneSpring GX v11.5軟件對時間進行歸一化和差異化分析。以倍數變化＞2且P ＜0.05為存在差異。

1.3 用實時熒光 RT-PCR 法檢測組織中LINC01614的水平 用1.2中所合成的c DNA 根據SYBR Premix Ex Taq T M Ⅱ熒光定量PCR 試劑盒(上海生工生物工程有限公司)說明進行PCR擴增。擴增條件為95 ℃下預變性15 min，然后在94 ℃下變性15 s，在56 ℃下退火30 s，然后在70 ℃下延伸30 s，并重復40個循環。LINC01614引物序列：正向引物為5'-ACAGGGGAGGTGATAGCATT-3'，反向引物為5'-GACCAAAAGCCTTCATACATCTC-3'；GAPDH 引物序列：正向引物為5'-TCCCATCACCATCTTCCAG-3'，反向引物為5-GGTATCCATCGCCATGCTC-3'。每個標本做3個復孔。用實時熒光定量PCR 儀檢測對其表達量進行結果分析，以GADPH 作為內參，采用2-△△Ct法計算mRNA 的相對表達量。

1.4 統計學分析 采用SPSS 19.0進行統計分析。計量資料以x-±s 表示，兩組比較采用t 檢驗；多組用單因素方差分析進行判斷；繪制出受試者工作特 征 (receiver operating characteristic curve，ROC)曲線，確定LINC01614 診斷NSCLC 的效能參數；采用Kaplan-Meier曲線進行生存分析，采用多元逐步COX 回歸模型 (α入=0.05、α出=0.10)探討影響非小細胞肺癌患者預后的相關因素。P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 癌組織和癌旁組織之間l nc RNA 表達差異 對16個樣本進行l nc RNA 微陣列分析 (癌組織和癌旁組織各8 個)，NSCLC 患者中發現3 261個l nc RNA 表達水平顯著不同，其中1 205個表達上調，2 056個表達下調。同時，LINC01614 為最紊亂的lnc RNA，在癌組織中表達上調，是癌旁組織的22.92倍。通過基因本體論分析和生物學途徑分析發現，LINC01614參與了轉化生長因子β、P53和Wnt等NSCLC發病經典途徑，(圖1、2)。

2.2 癌組織和癌旁組織中LINC01614的表達水平的比較 癌組織中LINC01614表達較癌旁組織增高(24.28±3.51比1.00±0.15)，差異有統計學意義(t=57.387，P ＜0.05)。與微陣列數據一致。

2.3 LINC01614的表達與NSCLC 患者臨床病理特征的相關性 不同性別、年齡、吸煙史、病理類型及腫瘤長徑的NSCLC患者癌組織中LINC01614相對表達量比較，差異均無統計學意義 (P 值均＞0.05)。不同臨床分期、組織分化程度和是否發生淋巴結轉移的 NSCLC 患者癌組織中LINC01614相對表達量比較，差異均有統計學意義(P 值均＜0.05)；臨床分期越高、組織分化程度越低、發生淋巴結轉移患者，LINC01614 相對表達量越高(表1)。

圖2 差異表達的長鏈非編碼c RNA 的火山圖

2.4 LINC01614作為NSCLC 潛在生物標志物的診斷價值 通過繪制ROC 曲線發現，曲線下面積為0.788(95%CI：0.710～0.821)，以LINC01614相對表達量26.14作為截斷值，將NSCLC 患者分為高表達組(26例)和低表達組(49例)，其診斷敏感度為58.62%，特異度為87.24%，對NSCLC具有診斷價值(圖3)。

表1 LINC01614的表達與非小細胞肺癌患者臨床病理特征的相關性 (x-±s)

圖3 非小細胞肺癌患者的LINC01614 受試者工作特征曲線

2.5 LINC01614表達對NSCLC 患者生存時間的影響 高表達組和低表達組的總生存期分別為22.2個月 (95%CI：20.1～34.6個月)和38.5個月(95%CI：25.3～45.5個月)，高表達組的生存時間明顯低于低表達組，差異有統計學意義 (Z =10.248，P ＜0.05)，見圖4。

圖4 LINC01614 表達與非小細胞肺癌患者總生存率的關系

2.6 NSCLC患者預后多因素分析 將NSCLC 患者臨床病理特征及LINC01614表達情況等變量納入，進行多元COX 比例風險逐步回歸分析，結果顯示回歸方程整體差異具有統計學意義 (χ2=35.136，P ＜0.001)，臨床分期晚 (Ⅲ期和Ⅳ期)、低分化、LINC01614 高表達和伴有淋巴結轉移為NSCLC患者預后的獨立危險因素 (P ＜0.05)，見表2。

3 討論

lnc RNA 的發現是后基因組時代的一個重要前沿。盡管lnc RNA 沒有表現出編碼蛋白的潛能，但它參與了一系列重要的生物活動，包括胚胎發育、應激反應、選擇性剪接和染色質重塑。它們還對細胞增殖、細胞周期調節、生存和代謝等許多細胞過程產生重要影響[9]。l nc RNA 失調已被證實在腫瘤發生、進展和轉移中發揮重要作用，如l nc RNAPVT1在胃癌中升高，通過調節P15和P16信號通路促進癌細胞增殖[10]。隨著包括高通量測序和基因芯片在內的基因組技術的飛速發展，人們已經做出了巨大努力來鑒定與癌癥相關的lnc RNA。但與肺癌相關的l nc RNA 的研究仍處于起步階段，NSCLC 相關lnc RNA 的數據有限。因此，篩選出與NSCLC相關的l nc RNA 具有重要意義，可以成為NSCLC診斷和預后判斷的工具，甚至可以作為新的治療目標。本研究利用l nc RNA 微陣列分析NSCLC患者癌組織和癌旁組織l nc RNA 表達，發現了3 261個l nc RNA 表達水平顯著不同，其中1 205個表達上調，2 056個表達下調；同時，LINC01614為最紊亂的l nc RNA，在癌組織中表達上調，是癌旁組織的22.92倍，通過RT-PCR 檢測也證實了我們的分析。

表2 NSCLC患者預后影響因素多元COX 逐步回歸分析結果

通過分析LINC01614 的表達與NSCLC 患者臨床病理特征的相關性發現，TNM 分期越高、組織分化程度越低、發生淋巴結轉移患者，LINC01614相對表達量越高。同時，本研究發現LINC01614的高表達與NSCLC患者生存時間顯著相關，預后多因素分析顯示LINC01614高表達為非小細胞肺癌患者預后危險因素，上述數據表明，LINC01614有潛力成為NSCLC 的預后生物標志物。此外，ROC 分析表明，LINC01614可以為從正常組織中篩查NSCLC組織提供有效的方法。許多NSCLC患者是經皮經胸針穿刺活檢或支氣管鏡活檢確診，但這些方法獲得的腫瘤組織相對較少，且可能破壞腫瘤細胞。因此，腫瘤組織的病理形態學改變可能是不典型且難以識別的[11]，檢測組織中的LINC01614表達水平可能有助于確定病變的性質。

有研究表明，在癌癥患者的血漿織中可以檢測到游離的DNA、micro RNA、l nc RNA。更重要的是，即使在極端p H 和RNase A 消化等惡劣條件下，l nc RNA 也能在血液中保持穩定[12]。而非編碼RNA 的釋放進入血液被認為是與腫瘤細胞的凋亡和壞死有關，也是分泌的結果[13]。因此，可以認為腫瘤組織中lnc RNA 的含量水平與患者血液中的含量是平行的。這些特征使得l nc RNA 有可能成為理想的癌癥診斷和預后的非侵入性生物標志物。如血漿中l nc RNA POU3F3 可作為食管鱗癌診斷的生物標志物[14]。同時，有研究報道了在血漿中檢測l nc RNA H19 可以用于胃癌的檢測[15]。雖然LINC01614在NSCLC組織中表現出了良好的診斷效果，但是接下來我們將進一步驗證LINC01614在NSCLC患者血液中的良好診斷效果。

綜上所述，通過l nc RNA 微陣列對l nc RNA 在NSCLC中的表達譜進行分析和RT-PCR 檢測，證實了LINC01614 在NSCLC 組織中高表達，并與NSCLC 的 惡 性 程 度 有 關。 此 外， 組 織 中LINC01614水平升高可能對NSCLC患者的預后有很大的提示作用。然而，仍需要進一步的研究來證實LINC01614 表達失調對促進腫瘤發生的作用機制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突