基于網絡藥理學的辛夷治療過敏性鼻炎作用機制研究

周毅葉 ，王祺，賈妍卓，梁玉琳，王堯，王雨琪，鄒俊波，2，史亞軍，2，張小飛，2

1.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫藥大學藥學院陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712046

辛夷又稱望春花，為武當玉蘭或玉蘭的干燥花蕾，始載于《神農本草經》。辛夷能溫中解肌，善于通透九竅，尤善通鼻竅，對鼻炎、頭痛、鼻塞、齒疼等有良好的治療作用。辛夷外可祛風除寒，內可升達肺胃清氣。現代藥理研究表明，辛夷揮發油可收縮鼻黏膜血管，促進黏膜分泌物吸收，進而保護鼻黏膜，減輕鼻腔炎癥，有局部抗過敏、收斂、刺激和麻醉、抑菌、抗炎作用[1-2]。

過敏性鼻炎屬中醫學“鼻鼽”范疇，臨床表現為鼻癢、噴嚏、流清涕、鼻塞等。辛夷為治療過敏性鼻炎常用藥，其作用機制尚不明確，藥效成分和核心靶點蛋白有待探究。本研究應用網絡藥理學方法，通過篩選辛夷活性成分作用靶點和疾病靶點，建立藥物-靶點-疾病網絡，探討辛夷治療過敏性鼻炎的作用機制，為其藥理研究提供依據。

1 資料與方法

1.1 辛夷活性成分篩選

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），在“Herb name”詞條框中輸入“辛夷”，獲取辛夷條目，點擊進入并獲取分子信息，包括活性成分的分子名稱（molecule name）、口服生物利用度（OB）、相對分子質量（MW）、類藥性（DL）等。以OB≥30%和DL≥0.18 作為條件篩選辛夷的活性成分。

1.2 辛夷活性成分相關蛋白靶點獲取

根據篩選得到的活性成分，在TCMSP 中點擊“Related Targets”，獲取成分的“Targets Information”，得到該成分作用的靶蛋白名（target name）。在Uniprot（http://www.uniprot.org/）中，使用Uniprot KB 檢索功能，在檢索框中輸入靶蛋白名，檢索條件為“organism：homo sapiens”和“reviewed：yes”，獲取基因名（gene name）和Uniprot ID。檢索結果以.exe格式導出，保留不同成分作用蛋白靶點基因條目，包括辛夷活性成分對應人類的相關蛋白靶點基因及其對應Uniprot ID。

1.3 辛夷成分-靶點網絡構建

將辛夷活性成分和相關作用靶點導入Cytoscape3.7.1 軟件，構建成分-靶點網絡，使成分-靶點關系可視化，并進行網絡拓撲學分析，以自由度（degree）為篩選參數，進行化合物成分和蛋白靶點的篩選。在該網絡中，活性成分與蛋白靶點均由節點（node）表示，二者的作用關系用邊（edge）表示，最終得到成分-靶點網絡圖。

1.4 過敏性鼻炎相關靶點基因獲取

通過TTD（https://db.idrblab.org/ttd/）、DrugBank（https://www.drugbank.ca/）、DisGeNET（http://www.disgenet.org/web/DisGeneT/menu/home ）、OMIM（http://www.omim.org/）數據庫，以“allergic rhinitis”為關鍵詞檢索過敏性鼻炎相關基因，分別獲取過敏性鼻炎相關基因和蛋白靶點信息，對數據進行整理合并，并刪除重復值（相同的Gene 簡稱），得到包括基因、對應靶點名稱（target name）和UN 結果（Uniprot）的Excel 文件。

1.5 辛夷活性成分靶點與過敏性鼻炎疾病靶點交集數據獲取

建立辛夷活性成分靶蛋白的Excel 文件，包括分子名稱（molecule name）、成分編號（RST ID 自定義）、基因名（gene names）和Uniprot ID（Entry ID，單一基因的標準化，Uniprot 數據庫中的唯一編號）和蛋白名（protein names）。建立過敏性鼻炎相關靶蛋白的Excel 文件，包括蛋白名（protein names）、基因名（gene names）和Uniprot ID（Entry ID）。對過敏性鼻炎疾病靶點與辛夷活性成分靶點運用Excel 篩選功能，以“gene names”為查詢條件，映射出每個活性成分與過敏性鼻炎相關靶蛋白的交集，獲得辛夷活性成分靶蛋白與過敏性鼻炎靶蛋白交集的關鍵靶點，包括蛋白名、基因名和Uniprot ID。

1.6 交集蛋白靶點相互作用網絡構建

檢索String 數據庫（https://string-db.org/），點擊“Multiple Proteins”，在“List Of Names”詞條框中輸入交集靶點，并在“Organism”詞條框中選擇“Homo sapiens”，點擊“SEARCH”，點擊“CONTINUE”，獲取交集蛋白靶點的相互作用關系，保存文件并導入Cytoscape3.7.1 軟件，繪制交集靶點網絡圖，以自由度（degree）為篩選參數，進一步調節，使交集蛋白靶點之間的關系更為明確。

1.7 交集靶點生物過程和KEGG 通路富集分析

運用R 語言clusterProfiler 包對辛夷活性成分治療過敏性鼻炎靶點進行GO 分析，獲取其生物過程（biological process，BP），并進行KEGG 通路富集分析。

1.8 分子對接

為進一步驗證活性成分與蛋白靶點之間的結合活性，利用Discovery Studio 4.0 軟件，將前5 個靶蛋白與其對應的藥物活性成分進行分子對接，并對結果進行分析。在DrugBank（https://www.drugbank.ca/）中得到靶蛋白對應的陽性藥，從蛋白數據庫PDB（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）中搜索并下載靶蛋白及陽性藥三維結構，作為分子對接的載體。從PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索并下載配體的.sdf 格式文件，用于與蛋白質、陽性藥結構的分子對接。利用Discovery Studio 4.0 的Clean Protein 工具對蛋白結構進行以下操作：刪除配體分子和水分子、不全不完整殘基、多余蛋白質構象，并加氫和分配相關電荷。利用LibDock 工具，Comformation Method 參數設置為“BEST”，Docking Preferences 參數設置為“High Quality”，其余參數為默認，記錄配體在此口袋的打分值LibDock Score。

2 結果

2.1 辛夷活性成分

通過TCMSP 檢索到184 個辛夷化合物，篩選出19 個活性化合物，見表1。

2.2 辛夷活性成分對應靶蛋白

通過TCMSP分別獲取19個成分作用的相關靶點蛋白名稱，通過PubChem 數據庫Search PubChem 檢索得到對應Canonical SMILES，再用SwissTargetPrediction數據庫檢索Predict targets，得到藥物作用的相關靶點蛋白名稱，合并后共獲取928 條靶點信息。

表1 辛夷活性化合物基本信息

2.3 辛夷活性成分-靶點網絡

藥物活性成分-靶點網絡由431 個節點組成，包括18 個藥物成分節點和413 個蛋白靶點節點，自由度最大為116，最小為1，平均自由度4.292，以大于平均自由度為條件篩選核心靶點網絡，見圖1。主要活性成分（自由度）包括異二氫氟喹諾酮A（116）、加爾加拉文（113）、鵝掌楸樹脂酚B 二甲醚（108）、去核劑a（105）、去甲檳榔堿（104）等。

圖1 辛夷核心成分-靶點網絡

2.4 過敏性鼻炎相關靶點

從TTD、DrugBank、DisGeNET、OMIM 數據庫中分別獲取到27、10、163、266 條疾病相關靶點，去重后得到336 條過敏性鼻炎相關基因靶點信息。

2.5 辛夷成分靶點與過敏性鼻炎疾病靶點交集分析

辛夷成分靶點（353 個）與過敏性鼻炎疾病靶點（283 個）取交集，得到43 個靶點基因，分別為PTGS2、ADRB2、ALOX5、GABRA2、PIK3CG、PIK3CA、PIK3CD、PIK3CB、NR3C1、TBXA2R、PTGER3、HIF1A、KNG1、PTGS1、MMP9、GSTP1、ADRA2C、CHRM2、CHRM3、ADAM10、TSPO、PDE5A、HRH3、HRH4、IRAK4、PDE4D、PRKCQ、CCR4、ADORA2A、TLR9、TGFBR1、PLA2G7、IDO1、PLAT、CNR1、CNR2、PRKCG、ICAM1、SERPINE1、CFTR、CCR5、FABP4 和C5AR1。

2.6 交集蛋白靶點相互作用網絡

利用String 獲取交集蛋白靶點網絡，包含40 個節點（3 個靶點未參與）、149 條邊，平均自由度為6.93，平均局部聚類系數為0.673，見圖2。

2.7 成分-靶點-疾病網絡

辛夷治療過敏性鼻炎成分-靶點-疾病網絡由60個節點組成，包含17 個藥物成分節點和43 個蛋白靶點節點，見圖3。該網絡最大自由度為16，平均自由度為4.1。取大于平均自由度的節點作為辛夷治療過敏性鼻炎成分-靶點-疾病核心網絡，包含8 個成分節點和6 個蛋白靶點節點，見圖4。8 個成分（自由度）分別為鵝掌楸樹脂酚B 二甲醚（16）、加爾加拉文（16）、異二氫氟喹諾酮A（16）、去核劑a（14）、亞油酸乙酯（13）、去甲檳榔堿（13）、(-)-白玉蘭亭B（11）山蒟酮（10）。6 個蛋白靶點分別為前列腺素G/H 合成酶2（PTGS2）、前列腺素G/H 合成酶1（PTGS1）、PI3 激酶p110α 亞單位（PIK3CA）、花生四烯酸鹽5-脂氧合酶（ALOX5）、前列腺素EP3 受體（PTGER3）、毒蕈堿乙酰膽堿受體M3（CHRM3），其自由度分別為15、7、6、6、5、5。

圖2 辛夷治療過敏性鼻炎交集蛋白靶點相互作用網絡

圖3 辛夷治療過敏性鼻炎成分-靶點-疾病網絡

圖4 辛夷治療過敏性鼻炎成分-靶點-疾病核心網絡

2.8 生物過程和KEGG通路富集分析

GO富集分析得到613條生物過程，核心生物過程見圖5。可以看出，辛夷治療過敏性鼻炎與5條生物過程緊密相關，分別為炎癥反應的調節、白細胞遷移、體液水平調節、對外界刺激反應的積極調節、對細菌來源分子的反應。KEGG 通路富集分析得到95條調控通路，核心通路見圖6。可以看出，辛夷治療過敏性鼻炎與5條通路緊密相關，分別為刺激神經組織中的交互、膽堿能突觸、HIF-1信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、趨化因子信號通路。

2.9 分子對接分析

選擇成分-靶點-疾病核心網絡中自由度居前5位的蛋白靶點，與其對應化合物進行分子對接，采取剛性對接，利用Discovery Studio4.0軟件進行陽性藥驗證，結果見表2、表3，相互作用關系見圖7～圖11。

圖5 辛夷治療過敏性鼻炎BP富集分析

圖6 辛夷治療過敏性鼻炎KEGG 通路富集分析

表2 辛夷治療過敏性鼻炎核心靶點與化合物結合活性得分

表3 辛夷治療過敏性鼻炎核心靶點與化合物、陽性藥結合活性得分比較

圖7 ALOX5與XY-14 相互作用關系圖

圖8 PTGER3與XY-01相互作用關系圖

圖9 PTGS1與XY-19 相互作用關系圖

圖10 PTGS2與XY-12相互作用關系圖

圖11 PIK3CA 與XY-01相互作用關系圖

3 討論

過敏性鼻炎常為基因、空氣環境因素，或兩者共同作用所導致，主要為塵、螨、花粉等[3-4]吸入性變應原侵襲鼻腔，并誘導特異性IgE 抗體與之反應而發病。近年來，隨著環境條件的改變，空氣環境成為過敏性鼻炎的主要致病因素[5]。中醫認為，該病發生與外感風寒、臟腑功能失調或邪氣入侵鼻竅有關，并根據臨床表現將其分為腎陽虧虛型、氣虛寒型、氣虛血瘀型、外寒內熱型等。臨床需辨明寒熱和臟腑病位及其病機，根據不同證型，可采用溫陽補腎法[6]、溫肺散寒法[7]、補中益氣法[8]、活血化瘀法[9]、平調寒熱法[10]治療。辛夷善通鼻竅，故在過敏性鼻炎各證型的治療中多有使用。

本研究通過對辛夷主要活性成分的作用靶點進行篩選，并與過敏性鼻炎的疾病相關靶點取交集，篩選出辛夷治療過敏性鼻炎的活性成分-靶點-疾病網絡，對網絡中的核心靶點進行生物過程和信號通路分析。結果表明，辛夷治療過敏性鼻炎的主要活性成分為鵝掌楸樹脂酚B二甲醚、加爾加拉文、亞油酸乙酯等，PTGS2、PTGS1、PIK3CA、ALOX5、PTGER3等靶點是白細胞遷移、炎癥反應的調節、體液水平調節、對細菌來源分子的反應、對外界刺激反應的積極調節等生物過程的核心靶點。湯雁利等[11]研究康復新藥物的抗炎作用及其機制，結果表明康復新可抑制巨噬細胞的炎癥作用，是通過降低PTGS2基因的表達而抑制炎癥反應，進一步表明PTGS2與炎癥反應密切相關。廖世峨等[12]研究ALOX5與兒童哮喘易感性的關系，結果顯示ALOX5與哮喘的嚴重程度、過敏、肺功能指標等有關。同時，過敏性鼻炎可誘導哮喘，ALOX5基因與其易感性也存在密切關系[13]，表明ALOX5對過敏性鼻炎的易感性與過敏性有重要作用。膽堿能突觸、刺激神經組織中的交互、HIF-1信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、趨化因子信號通路等為辛夷治療過敏性鼻炎的主要信號通路。范雋等[14]研究HIF-1信號通路對鼻炎發病機制的影響，表明HIF-1信號通路與鼻腔內的鉤突黏膜組織密切相關。李影等[15]對腫瘤壞死因子參與炎癥反應免疫調節的研究指出，腫瘤壞死因子直接或間接募集并激活活化轉錄因子信號通路，誘導免疫反應和炎癥反應，從而參與炎癥性疾病。祁建妮[16]對microRNA-210調節炎癥反應的研究表明，固有免疫中的巨噬細胞識別細胞膜表面的模式識別受體，進而識別細菌和病毒，經過一系列信號轉化激活轉錄因子，轉錄因子與抗體結合后產生大量促炎因子、趨化因子，同時，促炎因子和趨化因子具有清除微生物感染的作用。另外，辛夷參與的體液水平調節、對外界刺激反應的積極調節的生物過程是治療過敏性鼻炎體內調節的主要過程。

本研究表明，辛夷活性成分可通過參與炎癥反應的調節、白細胞遷移、體液水平調節、對外界刺激反應的積極調節、對細菌來源分子的反應等生物過程，以及刺激神經組織中的交互、膽堿能突觸、HIF-1信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、趨化因子信號通路等生物通路發揮治療過敏性鼻炎作用。辛夷活性成分具有良好的抗組胺、抑制炎癥反應和促進免疫調節的作用，通過多靶點與多成分的協同作用，達到治療過敏性鼻炎的效果。本研究可為過敏性鼻炎治療藥物的實驗和臨床研究提供依據。