健脾清腸補腎方藥物血清對破骨細胞凋亡途徑的影響

張亞利，陳倩，戴彥成，2，張紫薇，唐志鵬

1.上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海中醫藥大學脾胃病研究所，上海 200032；2.上海中醫藥大學附屬上海市中西醫結合醫院，上海 200082

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種常見的消化系統疾病，屬炎性腸病范疇。研究顯示，UC可影響患者骨骼及鈣鹽的沉積[1-3]。近年來，UC 并發骨質疏松癥研究備受關注[4-5]。骨質疏松癥是一種以骨量低下、骨微結構破壞為特征的全身性骨病，表現為骨脆性增加、易骨折，是UC 患者常見腸道外表現之一[6]。骨重建對維持骨骼完整性具有重要作用，其由成骨細胞骨形成和破骨細胞骨吸收共同協調完成，破骨細胞異常導致這種內穩態被打破。骨質疏松細胞學特征為破骨細胞的破骨活性強于成骨細胞的成骨活性，導致骨質逐漸被吸收。因此，破骨細胞凋亡直接影響骨吸收，從而影響骨重建過程。研究發現，骨質疏松癥中破骨細胞凋亡受到抑制[7-9]。前期臨床研究表明，健脾清腸方治療UC 取得較好療效[10-12]。健脾清腸補腎方是在健脾清腸方基礎上的拓展方，本實驗從破骨細胞凋亡機制入手，觀察健脾清腸補腎方藥物血清對成熟破骨細胞凋亡的影響，探討其治療UC并發骨質疏松癥發揮藥效的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物

健脾清腸補腎方（黃芪30 g，黨參15 g，益智仁12 g，補骨脂9 g，馬齒莧30 g，甘草6 g，木香6 g，地榆15 g），飲片由上海中醫藥大學附屬龍華醫院中藥房提供。浸泡飲片，煎煮2 次，過濾藥液，濃縮后濃度為含原藥材1.23 g/mL，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2 細胞

RAW264.7 細胞株來源于Abelson 鼠科白血病病毒誘導腫瘤，購于中國科學院上海生命科學研究院。

1.3 動物

雄性SD 大鼠，SPF 級，6 周齡，體質量（200±10）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（滬）2013-0017。飼養于上海中醫藥大學動物實驗中心SPF 級動物房，溫度（23±3）℃，相對濕度35%～45%，光照12 h，自由攝食飲水。

1.4 主要試劑與儀器

核因子-κB 受體活化因子配基（RANKL）、巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF），R&D 公司，批號分別為315-11、315-02；Bcl-2 抗體、Bax 抗體，CST 公司，批號分別為2876、2772；TRAP 染色試劑盒，Sigma公司，批號387A；Annexin V-FITC 和碘化丙啶凋亡檢測試劑盒，BD 公司，批號556420。低溫離心機（Eppendorf 公司，5804R 型），Accuri C6 流式細胞儀（Becton-Dickinson），純水儀（Heal Force 公司），垂直電泳儀（Bio-Rad 公司，PowerPac 型），全自動數碼凝膠成像系統（G：Box Chemi XT4，Syngene 公司）。

1.5 藥物血清制備

將實驗大鼠隨機分為2 組，每組5 只。健脾清腸補腎方組大鼠按15 mL/kg 給予健脾清腸補腎方煎劑灌胃，空白對照組給予等體積蒸餾水灌胃，2 次/d，連續3 d。末次給藥后1 h，乙醚麻醉，腹主動脈取血，無菌離心管收集，4 ℃靜置2 h，4 ℃、3000 r/min 離心15 min，混勻合并同組大鼠藥物血清，56 ℃恒溫水浴滅活30 min，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，凍存管分裝，置于-80 ℃冰箱貯存備用。配制成終濃度分別為2.5%、5%、10%的健脾清腸補腎方藥物血清培養液[終濃度（%）＝加入血清體積÷總體積×100%]，即低、中、高劑量健脾清腸補腎方。

1.6 RAW264.7 細胞形態學觀察

將RAW264.7 細胞置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養箱中，使用DMEM 完全培養液（含10%胎牛血清、100 U/L 青-鏈霉素和2.5 mg/mL 兩性霉素B）培養，每1～2 d 更換1 次培養液。待細胞融合至70%，用細胞刮將貼壁的RAW264.7 細胞刮下，離心后取新鮮培養液重懸，輕柔吹打均勻，細胞按1∶4 傳代。

1.7 破骨細胞誘導及鑒定

細胞經計數，將RAW264.7 細胞按1×104個/cm2的濃度接種于培養板，加入100 ng/mL RANKL 和10 ng/mL M-CSF 共同誘導其分化。培養6 d 后，破骨細胞抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色鑒定。加入臨時配制的TRAP 染色液，將培養板置于37 ℃恒溫箱，避光孵育1 h；再用蘇木精復染3 min，PBS 沖洗3 次，倒置相差顯微鏡下觀察及拍片。光鏡觀察TRAP 陽性多核（≥3 個）破骨細胞。

1.8 Annexin V/PI 雙染色法檢測破骨細胞凋亡

將破骨細胞接種于6 孔板，健脾清腸補腎方藥物血清（2.5%、5%、10%）對誘導分化成熟的破骨細胞進行干預，正常血清培養為空白對照。按不同培養條件分別加入培養液培養2 d；將6 孔板中每孔細胞培養液吸出至15 mL 離心管，每孔再加入400 μL 胰蛋白酶消化3 min，1 mL 完全培養液終止消化，500 μL培養液洗孔1 次；將消化的細胞加入同一離心管，2000 r/min 離心5 min，棄上清液，用1 mL 預冷無菌PBS 洗細胞沉淀1 次，用PBS 輕輕重懸細胞并計數，調整細胞濃度為1×106個/mL；取100 μL 細胞懸液，加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻；室溫避光孵育15 min。加入5 μL 碘化丙啶（PI）染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置5 min；加300 μL 結合液；用流式細胞儀進行檢測，Annexin V-FITC 為綠色熒光，PI 為紅色熒光。

1.9 Western blot 檢測破骨細胞Bcl-2 和Bax 蛋白表達

按不同培養條件（空白對照組和健脾清腸補腎方低、中、高劑量組）培養細胞2 d；取干預后2×106個破骨細胞，棄培養液，PBS 清洗2 次；培養皿中加入100 μL 預冷的蛋白裂解液，置冰上10～20 min；細胞刮刮下細胞收集至EP 管，4 ℃、12 000 r/min 離心5 min，吸取上清液至另一新離心管；取少量上清液，用Bradford 檢測試劑盒進行蛋白質定量；每個樣品上樣20 μg，經SDS-PAGE 分離后，轉膜、封閉，加入TBST 稀釋的Bcl-2 和Bax 一抗（1∶1000），4 ℃孵育過夜；TBST 洗膜后加入1∶2000 稀釋的二抗，室溫搖床上孵育2 h；TBST 洗膜；將PVDF 膜放入凝膠成像儀中調整位置和焦距，于PVDF 膜正面的目的條帶上滴加ECL 發光劑（試劑A 液與試劑B 液等體積混勻），動態集成5～15 min 并拍照，用Gel-Pro 分析軟件對條帶進行定位和分析。

1.10 統計學方法

采用SPSS26.0 和GraphPad Prism8.0 統計軟件進行分析。計量資料以表示，對所有數據進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，對符合正態分布且方差齊的數據用方差分析，進行多組間比較，組間比較用LSD-t檢驗，不符合正態分布或方差不齊的數據用非參數檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 破骨細胞觀察及鑒定結果

RAW264.7 細胞剛貼壁時呈類圓形；第2 日可見伸出的偽足、單核，極少數有2 個核；第3 日可見細胞開始發生融合，逐漸形成空泡樣多核巨噬細胞；第5 日細胞可融合形成破骨樣細胞。RAW264.7 細胞經RNAKL＋M-CSF 聯合誘導培養4 d，可見少量TRAP染色陽性細胞，類圓形，體積比單核細胞大數倍；培養6 d，TRAP 染色陽性的細胞形狀不規則，多核（≥3 個），體積大，直徑可達50～100 μm，有偽足，可見囊泡，鏡下細胞核呈紫藍色，胞漿中TRAP 活性部位呈深紅色顆粒。見圖1。

2.2 健脾清腸補腎方對破骨細胞凋亡的影響

通過Annexin V/PI 雙染色法染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡。結果顯示，空白對照組破骨細胞早期凋亡率和總凋亡率分別為5.17%、6.68%，與空白對照組比較，健脾清腸補腎方各劑量組破骨細胞凋亡率均明顯升高（P＜0.05），其中健脾清腸補腎方高劑量組最顯著，分別為15.21%、17.82%。見圖2、圖3。

圖2 破骨細胞Annexin V/PI 雙標記法流式細胞圖

圖3 各組破骨細胞凋亡率比較（，n＝3）

2.3 健脾清腸補腎方對破骨細胞Bcl-2 和Bax 蛋白表達的影響

與空白對照組比較，健脾清腸補腎方各劑量組Bcl-2 蛋白表達均明顯下調，Bax 蛋白表達均明顯上調，Bcl-2/Bax 比值明顯下降，差異均有統計學意義（P＜0.05），其中健脾清腸補腎方高劑量組變化最顯著。見圖4、圖5。

圖4 各組破骨細胞Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax 水平比較（，n＝3）

圖5 各組破骨細胞Bcl-2 和Bax 蛋白免疫印跡圖

3 討論

UC 并發骨質疏松癥可歸屬中醫學“骨痹”范疇，感受外邪、飲食不節、情志失調及稟賦不足時，易致脾腎損傷，脾虛運化無力，痰濕內生，日久化熱，致濕熱、痰濁、瘀毒內生，與氣血搏結，壅滯于腸道；腎虛則精虧，骨無所養。脾腎虧虛是UC 并發骨質疏松癥發病的關鍵環節，濕熱蘊結腸道是其重要病機。健脾清腸補腎方是本課題組針對UC 并發骨質疏松癥創立的臨床協定方劑，是在前期研究健脾清腸方基礎上的拓展方，為健脾清腸方去白及、黃連，加益智仁、補骨脂，由黃芪、黨參、益智仁、補骨脂、地榆、馬齒莧、木香、甘草8 味藥組成。方中黃芪、黨參、益智仁、補骨脂健脾補腎，地榆、馬齒莧清熱涼血止痢，木香行氣止痛，甘草調和諸藥。全方標本兼治，共奏健脾清腸補腎之功。

正常成年人體內骨轉換需通過成骨細胞和破骨細胞的分化、激活及凋亡保持平衡。骨質疏松癥通常表現為骨質量和骨密度的降低，以及骨組織微結構的改變。

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，是由英國阿伯丁大學病理學家Kerr 等[13]1972 年首次提出，其廣泛存在于多細胞生物的各種器官和組織中。線粒體凋亡通路是經典的細胞凋亡途徑之一。線粒體是細胞產生能量的重要細胞器，是細胞氧化磷酸化和呼吸鏈的中心，也是細胞凋亡的調控中心。死亡受體介導的信號、生長因子抑制劑等許多因素均能使線粒體功能損傷，從而誘導細胞發生凋亡。健脾清腸補腎方藥物血清加入破骨細胞后，各劑量組破骨細胞凋亡率較空白對照組均顯著升高，且與藥物濃度呈正相關。提示健脾清腸補腎方可促進破骨細胞凋亡，高濃度健脾清腸補腎方藥物血清作用最顯著。

Bcl-2 家族是細胞凋亡的重要調控因子，由促凋亡和抗凋亡成員協同發揮作用。Bcl-2 可能通過干擾細胞色素C 的釋放從而阻斷Caspase 的激活，抑制細胞凋亡的發生；Bax 即Bcl-2 相關的X 蛋白，是Bcl-2家族中促凋亡的重要蛋白之一。Bcl-2 可與Bax 形成異二聚體。正常情況下，Bcl-2 和Bax 在細胞內保持相對平衡。當Bcl-2 相對含量高于Bax 時，促進Bcl-2/Bax 異二聚體的形成，抑制細胞凋亡；當Bax相對含量高于Bcl-2 時，則抑制Bcl-2/Bax 異二聚體的形成，從而促進細胞凋亡[14-16]。因此，這2 種蛋白在異二聚體中所占比例可影響對細胞凋亡的調控。本研究發現，健脾清腸補腎方藥物血清可提高破骨細胞凋亡率，其機制可能是通過下調Bcl-2 蛋白的表達、上調Bax 蛋白的表達而導致Bcl-2/Bax 比值下降，從而促進細胞色素C 等促細胞凋亡因子向細胞質釋放而發揮作用。健脾清腸補腎方低、中、高劑量組均可促進破骨細胞凋亡，其中以健脾清腸補腎方高劑量組最明顯。

綜上，健脾清腸補腎方藥物血清可促進破骨細胞凋亡，其機制可能是通過線粒體凋亡途徑而發揮作用，通過下調Bcl-2 蛋白的表達，上調Bax 蛋白的表達，從而促進破骨細胞凋亡。健脾清腸補腎方各劑量組均可促進成熟破骨細胞凋亡，其中以健脾清腸補腎方高劑量組最明顯。