鐵線蓮屬植物SSR-PCR反應體系的建立與優化

李勇慧，于相麗，周曉君

（洛陽師范學院 生命科學學院，河南 洛陽 471934）

鐵線蓮屬（CLematis L.） 是毛茛科（Ranuncu－Laceae）植物，大約有300多種，河南省的北部、南部和西部山區是大多數鐵線蓮分布的地區[1]。鐵線蓮有較高的藥用價值，如治療風濕、腫瘤，也有利于利尿等，這就使它的經濟價值也非常高[2]。另外，鐵線蓮屬植物有許多品種，花型多種多樣，顏色艷麗，再加上葉片的修飾，使鐵線蓮具有較高的觀賞價值，在城市綠化方面被廣泛使用[3-4]。簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）亦可稱為微衛星（microsatellite），是目前最常用的微衛星標記之一，在真核生物的基因組編碼區以及非編碼區廣泛地分布[5]?？梢愿鶕阎膫纫硇蛄性O計出引物用于PCR擴增，將所需的衛星位點擴增出來，最后使用聚丙烯凝膠電泳進行跑膠，使實驗結果更加直觀[6]。SSR分子標記技術相比于其他技術有許多優點，如良好的多態性，穩定性好，操作時難度不大，有較強的重復性，成本低等[7-8]。同時它的應用前景非常廣泛，近幾年在引物篩選、植物種質資源分析等多個方面都有它的身影。

目前對鐵線蓮遺傳多樣性的研究大多圍繞著細胞學和形態學這幾個方面[9]，少數的有關于分子方面的研究多集中在ISSR分子標記技術方面，如任夏萌等[10]利用ISSR分子標記技術對大葉鐵線蓮的種質遺傳多樣性進行了分析。但近年來SSR技術廣泛應用于各種植物的遺傳多樣性分析中，如吳文強等人[11]用SSR技術標記藜麥基因組相對位點并進行擴增，然后用PAGE進行檢測，對其遺傳多樣性進行分析，用同樣方法的還有張佳欣等人[12]。鐵線蓮屬植物SSR-PCR反應體系的優化及引物篩選方面尚未有人進行研究。因此，本實驗對鐵線蓮屬植物SSR-PCR反應體系進行優化研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗從洛陽市周邊不同區域的鐵線蓮屬植物中選取粗齒、陜西、太行、大葉和鈍萼五種鐵線蓮，并將其分別用 Tc、Ts、Tt、Td 和Te編號，然后進行實驗（見表1）。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取

采用改良的CTAB法對這五種鐵線蓮進行DNA提取。

1.2.2 檢測葉片DNA的提取結果

為了確定DNA是否被提取出來，本實驗將采用瓊脂糖凝膠電泳法對DNA進行檢驗，通過跑出來的條帶的亮度和清晰度來確定DNA是否被提取出來以及濃度高低。為了使實驗結果更加準確，用分光光度計對DNA的密度和其A260∶A280的比值來判斷DNA純度。

1.2.3 SSR-PCR反應體系的建立與優化

從剛提取的DNA中挑選出條帶明顯、亮度高的Ts1、Tc42、Tt51和Te8等4個DNA作為模板，用編號為30的引物對PCR反應體系進行優化。首先優化PCR的擴增體系，詳情如下：2×pcr mixture 5 μL，DNA 模板0.3 μL/0.5 μL/0.7 μL；正向和反向引物各 0.5 μL。

其次優化退火溫度，基于已經優化好的PCR的擴增體系，選擇條帶明顯、亮度高的Ts1、Tc42、Tt51和Te8 4個DNA作為模板，然后將退火的溫度設置成51℃、53℃和55℃，篩選出最佳退火溫度。

1.2.4 PCR擴增、電泳

用優化好的PCR的最佳反應體系和反應程序，從已經提取出來的DNA中選出最好的4個DNA，Ts1、Tc42、Tt51和Te8作為樣品，再挑選引物進行擴增。PCR擴增體系為：正反引物各 0.5 μL，ddH2O 3.5 μL，2×pcr mixture 5 μL，DNA 模板 0.5 μL，總體系共計 10.0 μL。PCR的擴增程序見表2，低溫保存產物。

表2 PCR擴增程序

將電壓設置成300 V，電流為150 mA，聚丙烯酰胺凝膠電泳3 h，然后進行銀染檢測。

2 實驗結果

2.1 模板濃度與最佳退火溫度篩選結果

以Ts1、Tc42、Tt51和Te8作為模板，用編號為30的引物對DNA模板的濃度梯度進行篩選。篩選結果如圖1所示，表明當體系中加入0.3 μL的DNA時，膠片上的條帶不太清晰，當體系中加入0.5 μL或者0.7 μL DNA時，膠片上的條帶清晰。

圖1 DNA濃度梯度篩選

以Ts1、Tc42、Tt51和Te8作為模板，將30號引物的退火的溫度設置成51℃、53℃和55℃進行溫度梯度篩選。篩選結果如圖2所示，在退火溫度為51℃和55℃時，擴增出來條帶不清晰，有拖尾現象，僅當53℃時，跑出來的條帶才清晰，即為30號引物的最佳退火溫度。

圖2 退火溫度梯度篩選

2.2 SSR引物篩選及擴增結果

用已經篩選出來的PCR最佳反應體系和純合程度高的Ts1、Tc42、Tt51和Te8這4個DNA，對已有的100條引物進行多態性篩選，從其中選擇出目標區段間有清晰條帶的、多態性豐富的、穩定性好的6條引物，以便用于后期的鐵線蓮種質遺傳多樣性分析。篩選出的最佳引物為分別為 CH-10、CH-15、CH-28、CH-30、CH-96、CH-100，最佳退火溫度分別為 53、52、51、53、52、51℃，引物篩選結果如圖3-圖5所示。

圖3 15、30、67、96、63、56、41 號引物篩選圖

圖4 42、28、89、80、13、32、10、7、37 號引物篩選圖

圖5 46號擴增結果

3 討論

朱芹等人[13]在優化刨花潤楠的SSR-PCR體系時發現Taq酶的濃度對實驗結果有很大的影響，并著重對其進行優化。本實驗則從DNA濃度方面優化體系。何仁鋒等[14]人在對菊花進行SSR-PCR體系優化時也曾對DNA濃度進行優化，并得出以下結論：一般而言，PCR擴增過程中模板DNA不會對PCR的結果產生多大影響，對結果有較大影響的是DNA的濃度，當實驗用到DNA濃度較高時，對實驗的結果也不會有很大影響。而本實驗所提取出來的DNA濃度較高，所以篩選最佳濃度時實驗結果不太明顯，但由于CTAB法提取的DNA相較于試劑盒法容易降解，再加上實驗做的時間較長，反復解凍DNA，使得DNA降解，造成跑膠時會出現拖尾現象。

同時退火溫度也影響實驗結果，本實驗參照周利宏[15]在研究百合遺傳多樣性時的方法，并以30號引物為例，同樣設置3個溫度梯度以確定引物的最佳退火溫度，實驗結果顯示當退火溫度過低即為51℃時，膠片上就會顯示出多條非特異性條帶，從而使實驗的效果不佳；若退火時溫度太高即為55℃時，則引物和DNA不能夠特異性地結合在一起，擴增效果也不好，在53℃也就是30號引物的最佳退火溫度時才能得到清晰的條帶。最后用篩選出的最佳體系和最佳反應程序篩選已有的100條引物，最終篩選出多態性較好的10號、15號、30號、46號、96號和100號引物，為日后進行鐵線蓮種質資源分析奠定基礎。