環境DNA技術在水生外來動物入侵研究中的應用*

文 遙 ，李德亮 ，劉小燕，曾 聰

（1.湖南農業大學 動物科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.上海交通大學 海洋學院，上海 200240）

外來入侵物種是指無意或故意引入非自然分布環境中的動物和植物，并對新的生境造成嚴重的負面影響[1]。隨著15世紀末16世紀初大航海時代的開啟，不僅帶來了區域間密切的交流，也促進了許多水生生物的擴散。自上個世紀以來，人類活動全球化的加速，外來生物入侵被視為導致水域生態系統中生物多樣性喪失和退化的重要因素之一[2]。不同于陸地生態系統，水域生態系統的外來入侵物種入侵更具隱蔽性，由于水域生態系統具有很高的連通性，一旦入侵成功極易擴張爆發，基本無法做到完全清除[3]。因此，有效地監測取決于對入侵物種的早期發現和準確識別。

目前，基于觀察法仍然是確定水域環境中是否存在外來入侵物種的主流方法，常見方法是根據目標物種采用電擊、捕撈、視覺或聲學調查等方法[4-5]。但是，這些常規方法中的大多數對于檢測低豐度物種（例如入侵初期的入侵物種或少量重新引入物種）不是非常有效。此外，在收集到樣品后，還需要進行分類鑒定，但這往往在本土物種和入侵物種形態相似的情況下變得更加棘手。現階段常規的形態學鑒定已無法滿足對水生外來動物入侵的監測，需要一種更快速、更準確、更標準化的物種識別方法，以便在外來入侵物種引入或擴散的初期階段及時進行監測，對外來入侵物種做到更具成本效益的根除和控制[6-7]。

近年來，隨著分子生物學研究手段的發展和成熟，一種基于環境DNA（eDNA）的非侵入性新檢測技術正逐步成為監測水生生物的熱門手段[8-9]。eDNA是指脫離生物體本身，游離在環境中的DNA，主要來源于生物體脫落到環境中的組織碎屑和排泄物等，其原理是采集少量環境介質（水或沉積物等），基于PCR擴增技術識別環境樣品中入侵生物的DNA，最后通過高通量測序、熒光檢測或者凝膠電泳技術完成對調查區域內入侵生物的識別和分析[10]。但目前基于環境DNA的檢測技術仍處于發展階段，很多方法仍在優化和摸索中，本文搜集已發表環境DNA技術檢測或監測水生外來動物入侵（不包括微生物和哺乳動物）的135個文獻（截止到2020年11月19），總結基于環境DNA檢測或監測水生外來動物入侵的研究進展，探討環境DNA技術在檢測或監測水生外來入侵種方面未來的主要研究方向。希望本文的綜述能夠促進環境DNA技術在檢測或監測水生外來入侵種相關方面的發展，并為相關研究人員利用環境DNA技術提供參考。

1 環境DNA技術在水生外來動物入侵檢測中的應用和發展

環境DNA起源于微生物領域，在2008年，Ficetola等[11]運用環境DNA技術在法國濕地成功檢測到入侵物種美國牛蛙，開啟了環境DNA在水生外來動物入侵研究和監測上的運用。此后幾年，環境DNA技術應用于水生外來動物入侵的監測和研究報道并不多見，直到2013年后關于監測水生入侵物種的文章迅速增加。總體而言，環境DNA技術在研究水生外來動物入侵的相關文獻出版呈上升趨勢，并在近年保持相對穩定趨勢（圖1）。

圖1 環境DNA技術在水生外來動物入侵檢測的應用情況

從研究生態系統來看，主要集中在淡水生態系統中（90%），進一步分析發現大多數入侵物種研究主要集中于航運交通要道或復雜的水域環境地帶，這可能是在貿易過程中商業船舶壓載水將入侵物種不小心攜帶入境有關。從研究報道的分布來看，研究基本都集中在發達國家，其中大部分研究來自于美國（49%），其后依次為西班牙（10%）、澳大利亞（8%）、英國（6%）以及日本（5%）等國家，而在水生外來動物入侵相對較為嚴重的中國，相關案例報道卻仍比較少見（3%），這可能是由于環境DNA技術在國內起步晚，除了方法需要在國內研究地進一步優化之外，也與國內對環境DNA研究技術接受和認可度有關[12]。

在研究對象上，魚綱入侵（53%）是最受人們關注的，其次是雙殼綱（12%）和甲殼綱（12%）居多，其中入侵美國五大湖區的鰱和鳙是目前備受矚目的研究對象。從研究內容來看，目前大部分研究集中在方法摸索上，包括建立方法（26.12%）和不同方法間的比較（44.78%）（圖1）。這是由于利用環境DNA技術對水生外來動物入侵進行調查的實驗操作及后續的生物信息學分析等流程的實施還沒有成熟的技術體系，各個環節仍處于在各種實踐探索中不斷完善并逐步達成共識的狀態[13-14]。

2 環境DNA技術對水生外來動物入侵檢測的方法

目前，不同研究所采用的方法都不盡一致，為此本文結合環境DNA的技術流程，包括樣品搜集、環境DNA富集、DNA提取、特異性引物設計和結果檢測等環節，梳理對水生外來動物入侵研究的主要方法，并分析各個方法的優勢和缺點。

2.1 樣品采集

在搜集到的研究中，基本以采集水樣獲取動物入侵物種的DNA。水樣采集量一般為15mL-100L不等，最常見的采樣體積是1L（23.08%）和2L（21.54%），在對海水和淡水生態系統采樣比較顯示，兩者采樣體積不存在差異。從已發表的文獻來看，采樣體積過小，會對檢測結果有一定的影響，但體積超過1L后則不存在明顯差異。除搜集水體之外，也有極少數研究報道采用沉積物作為樣品采集，一般為底泥的表層（圖2）。另外，少部分研究認為樣品采集和隨后環境DNA的捕獲和提取過程中需設置陰性對照組，以保證結果的可靠性[15]。

圖2 不同采樣與富集環境DNA在水生動物入侵研究中的比較

2.2 環境DNA富集

對生物入侵環境DNA的搜集方法，與其他環境DNA研究手段基本相同，通常是通過物理方法富集環境樣品中的DNA，主要有抽濾法、沉淀法、離心法獲取。不同于其他環境DNA研究，生物入侵的研究首先關注的是入侵范圍，由于環境DNA檢測物種有/無的靈敏度高，因此采樣通常不受到體積的限制，所以三種方法在水生外來動物入侵研究上均有運用，但最常見的還是抽濾法（圖2）。

沉淀法是指在水樣中加入乙醇、異丙醇或者乙醇-醋酸鈉等，利用相似相溶原理將DNA從液相中分離出來，從而達到富集的目的[16]。通常該方法只適用于小體積水樣（＜30mL），因為在處理過程中一般需要加入等體積或者大于樣品體積的沉淀劑，如果樣品體積過大則不便于后期處理。當然，因樣品體積過小可能會降低環境DNA檢測的概率，特別是對于入侵物種等低濃度目標物種的檢測，易造成假陰性現象[17]。

離心法是指通過高速離心使DNA從液相中分離開從而達到富集的目的，通常采用體積為50mL，從已發表的結果來看一般采用轉速4000rpm。由于設備的限制，離心體積通常不會過大，因此該方法也面臨與沉淀法類似的局限[18]。

抽濾法是指水樣通過小孔徑的濾膜將DNA富集至膜上，是富集環境DNA最常用的方法。不同于前兩者的局限，抽濾法通常不受采樣體積的限制，可以實現環境DNA富集量的最大化，這也是最常見的富集手段[19-20]。但抽濾法同樣存在影響富集的因素，首先過濾器孔徑的選擇會對環境DNA的富集產生重大影響。大部分水生外來動物入侵研究所采用的孔徑為1.5和0.45μm（圖2），但過濾器的最佳孔徑選擇在很大程度上取決于調查水域的水濁度和生物密度條件等。當水樣中存在大量懸浮物（如藻類或泥沙）時，孔徑較小則易發生堵塞，進而大大延長抽濾時間，一般可采用大孔徑濾膜進行預處理。因此，有必要預先了解所調查水域的水質情況來選擇適合的孔徑[21]。另一方面，富集DNA的載體也會影響環境DNA的富集，常用的過濾膜一般為玻璃纖維、硝化纖維、聚碳酸酯和聚醚砜等材質（圖2），由于玻璃纖維具有將DNA吸附到其表面的化學特性，這可能提高環境DNA的富集效率[17]。例如，有研究表明采用0.7μm玻璃纖維過濾能獲得更好的環境DNA富集效果，但這還需要更多的實驗結果來支撐[22]。

目前，對于哪種富集方法更優的結論尚未統一。部分研究表明乙醇沉淀法的環境DNA產量明顯優于抽濾法[23-24]，另一部分研究表明使用0.2μm的混合纖維素抽濾器和0.7μm的玻璃纖維抽濾器的環境DNA富集量更佳[25]，但也有學者認為兩種富集方法不存在明顯的差異[26]。從目前已有結果顯示，無論哪種富集方式均能成功檢測到入侵動物的DNA。

2.3 環境DNA提取方法與比較

環境DNA的檢測效果，往往與提取方法有著緊密的關系[27-28]。環境DNA富集后，由于其具有很高的靈敏度，大部分研究都選用操作簡單且回收率較高的DNA提取商業試劑盒，一般采用細菌DNA（40%）和動物組織（43%）DNA提取試劑盒。Amberg[29]等對DNeasy Blood and Tissue（Qiagen）試劑盒與 PowerWater微生物（Qiagen）試劑盒效果對比時，表明用DNeasy Blood and Tissue（Qiagen）試劑盒提取環境DNA的回收率明顯高于 PowerWater（Qiagen）試劑盒。Eichmiller[30]等對六種不同的商業試劑盒進行測試，發現Fast DNA SPIN與Qiagen PowerSoil試劑盒受到PCR抑制劑等影響較小，具有較高的回收率，適用于物種檢測或定量。除此之外，液相分離法（十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）和苯酚-氯仿-異戊醇（PCI））方法也常用于環境DNA的提取。此外，在環境DNA提取方案中加入適量蛋白酶K，可有效提高環境DNA的產量，這些可能更加適用于對DNA質量需求高的高通量測序[31]，如圖3所示。

圖3 不同的提取方法和擴增長度分布

2.4 特異性引物標記的選擇

基于環境DNA入侵物種檢測的準確性和有效性在很大程度上取決于引物標記的特異性。低分辨率引物與目標物種DNA的結合會出現非目的性擴增情況，易造成假陰性或假陽性現象[32]。

對現有基于擴增或測序的水生外來動物入侵物種環境DNA檢測引物進行了文獻檢索，該研究僅限于對檢測水生外來動物入侵而設計的引物，共117篇。由于水環境中環境DNA的濃度含量較低，再加上水生動物入侵早期種群密度小，受各種降解因素的影響極易斷裂成小的DNA片段；為提高檢測目標物種的成功率，一般選擇的引物片段不會超過 200bp（圖 3）。COI、Cytb、D-loop、16S和12S等線粒體基因是水生入侵物種檢測最為常見的擴增區域（圖4），其中COI在不同入侵物種環境DNA研究中使用最為廣泛，主要是具有長度適中（50-200bp），引物通用性好和易于擴增等優勢[33]。但有時單一的引物標記對于目標物種的檢測并不是唯一的選擇，通過使用多對引物集可有效提高分辨率，提高檢測結果可信度。總體而言，線粒體 DNA（mtDNA）拷貝數高于核 DNA（ncDNA），具有更高的PCR檢測率，大多數入侵物種的環境DNA分析都以mtDNA作為引物標記[34]。但mtDNA標記存在拷貝數可變、母系遺傳等缺陷，用來估計入侵物種生物量或生物體豐度存在一定的難度。有研究表明核糖體RNA基因（rDNA）的多個拷貝且固定拷貝數存在于核基因組中，在估計種群遺傳多樣性和定量入侵的種群動態具有更高的特異性和精確性[35]。

圖4 水生入侵動物DNA的研究物種類別和引物基因類型使用頻率

現階段，大部分開發的特異性引物都是針對單一水生動物入侵的研究，對于同時監測多個物種的報道仍比較少見。利用多重PCR等手段對多個物種同時檢測可以更加有效降低成本和提高效率，值得進一步探索。

2.5 環境DNA的檢測方法

水生外來動物入侵監測研究，一般關注檢測點是否存在入侵或者入侵的生物量，而針對不同的目的，環境DNA的檢測方法也可分為定性和定量檢測。定性檢測是指借助PCR技術，通過特異性引物在環境DNA樣品中進行擴增，根據擴增結果判斷物種的存在與否。定量檢測則是通過擴增產物的量來反映環境DNA中模板的濃度，最終確定動物入侵的相對量。

無論是定性還是定量檢測，其檢測手段又可分為基于凝膠電泳、熒光強度和高通量測序。凝膠電泳檢測手段是指利用常規PCR進行特異性擴增后，利用凝膠電泳將PCR所得的產物可視化，當正確長度的PCR凝膠條帶出現時表明檢測為陽性，即檢測到入侵動物的存在[36]。該檢測方法具有成本低且操作方便等優勢，還可以利用多重PCR等手段同時檢測多物種，提高檢測效率。基于熒光強度的檢測，主要包括熒光定量PCR（qPCR）和微滴度PCR（ddPCR）[37-38]。qPCR具有高特異性、敏感性以及定量等功能，也是檢測由定性向定量的過渡。ddPCR屬于最新的檢測技術，有研究將該技術與常規PCR和RT-qPCR用于同一入侵物種檢測，比較發現ddPCR能更精準地定量目標物種的環境DNA濃度，且分析誤差小。但該檢測技術因成本過高，使用該檢測技術的仍不多見[38]。無論是基于常規PCR還是其他擴增儀器的檢測方法，時間和經濟成本均相對較低，但這些方法主要針對單一水生動物入侵的檢測。雖然多重qPCR可用于多物種的檢測，但一般實際運用中也僅能檢測2-5類物種[17]。

面對多個物種入侵或者研究動物入侵對本土動物的影響時，大多學者則采用高通量測序方法檢測。該檢測方法主要使用通用引物對環境DNA樣品進行擴增，獲得該樣品中某一類生物的特定DNA片段后，通過高通量的擴增子測序和數據庫比對，從而得到物種組成信息和入侵物種的種類及數量信息[39]。不同于前面的檢測方法，高通測序的檢測不僅可以對多種入侵物種進行定性研究，還可以通過測序得到的片段數量分析生物量來預測入侵的程度及動物入侵對本地種群的影響。隨著高通量技術的發展，測序成本的快速下降，則可能促進該方法的廣泛運用。當然，多種方法聯合使用也能夠確保結果的置信度[40]。

3 環境DNA的優勢

對比傳統調查方法，環境DNA技術更加依賴實驗室內工作，大幅壓縮了野外調查和取樣的工作。不僅如此，環境DNA在成本和檢測效果方面有著更大優勢（見表1）。

表1 環境DNA檢測技術與傳統調查方式的對比

3.1 成本優勢

由于水域生態系統具有很高的連通性，連接著多樣的陸地生態系統，水生外來動物入侵調查面臨著調查范圍大以及多樣的地形地貌等挑戰。傳統的調查方法需要濕地調查和記錄，需要大量的時間、設備和人力保障野外調查。環境DNA則不存在這方面的限制，只需在調查區域搜集水樣，在較難達到的采樣區域，可以通過無人機或者無人采樣船完成。隨著測序成本的下降，后續分析和檢測的成本也在不斷降低，環境DNA的成本優勢也得到了進一步體現[41]。

3.2 檢測效果優勢

動物入侵的早期檢測非常重要，直接決定了后續控制和消滅的成本。但在早期，水生動物入侵數量少而且水域生態系統多樣的遮蔽物直接導致傳統方法的發現率極低，特別是對個體較小的動物。例如，Dejean[42]等在比較了傳統調查法（基于聽覺與視覺調查）與環境DNA技術對入侵法國西南部美國牛蛙的檢測靈敏度時，發現環境DNA技術調查共在38處采樣地發現了美國牛蛙的存在，而傳統調查法僅有7處，可見傳統調查法嚴重低估了美國牛蛙的分布情況。類似的結果，在調查了美國五大湖中鰱和鳙的入侵區域分布時也發現了[43]。

3.3 其他

傳統的調查方式如捕撈或電擊調查等進行監測時，監測方式自身對環境就具有高度破壞性，甚至對本土物種也有損傷。環境DNA只需采集水樣，對生境本身以及系統內的生物并無影響。另外，隨著社會和科技的發展，勞動力和分類學家的減少，環境DNA有望通過分子探針和無人設備等完成自動化分析、監測和預警，這也是傳統調查方法無法比擬的[41]。

4 限制環境DNA檢測的因素

利用環境DNA對水生動物檢測，雖然相較傳統調查方法有諸多優勢，但是由于入侵生境的不同和生物之間的差異，仍有一些因素會影響后續對目標物種的檢測概率。

4.1 環境DNA降解

環境DNA的質量直接關系到后續的檢測效果，如果環境DNA發生降解導致擴增失敗，則可能直接導致誤判。環境DNA從動物體內脫離后就開始降解，一般而言環境DNA脫落到水環境中可持續幾小時到45天不等，而其持續時間受水溫、紫外線、pH、鹽度和底層基質等因素的影響[44-46]。有研究表明，水溫不僅會影響環境DNA的釋放，還影響其降解的速率。水溫適宜的水域的環境DNA濃度一般較高，但水溫過高會使得微生物代謝間接加速環境DNA的降解[47]。此外，紫外輻射也會加快環境DNA的降解[48]。與淡水系統相比，海洋系統具有更高的鹽度和pH值以及更穩定的水溫等，這些特征都更有利于環境DNA的保存[49]。到目前為止，淡水系統中具有最快降解速率的水環境是pH偏酸性的河流（半衰期為0.7-1.2h）[50]。海水中環境DNA的衰變率保持在6.9-71.1h之間。沉積物中含有的環境DNA保存更為持久且覆蓋物種豐富，目前已被證實環境DNA在沉積物中的持續時間可達132天[51]。

4.2 環境DNA遷移

由于水體有流動性，環境DNA在從動物體內脫落后，會隨著水體發生擴散或者遷徙，如果設置采樣點間距過近，則有可能因為遷移出現假陽性。動態水環境（河流、溪流、海洋等）中環境DNA的遷移須考慮環境DNA的生態學特征（起源、狀態、運輸、衰變）。檢測到環境DNA的下游遷移距離隨水文條件和底層基質而變化，也可能因物種和密度而變化[52-53]。例如，有研究發現溪鱒的環境DNA的遷移距離超過0.24km[54]，大西洋鮭的能達到0.96km[55]，部分淡水魚類可以達到2-3km[56]。淡水貝類環境DNA的遷移距離可能更大，如河蚌可達10km[57]。除此之外，物種密度還可能影響環境DNA的下游遷移，物種密度越高，檢測到的物種遷移距離越遠[54]。

4.3 檢測抑制劑

環境DNA樣品中除了目標物種的DNA，其他混合物會影響檢測結果，易導致假陰性的出現[53]。在環境DNA的檢測分析時，抑制劑最常見的是抑制PCR擴增的物質。目前減輕PCR抑制的常用方法是添加緩沖液或稀釋樣品，但目標物種濃度過低時不提倡，或者添加制劑輔料血清白蛋白或Dax-8等[58]。盡管這些方法都能減輕潛在抑制劑的影響，但具體哪種最適用則根據樣品基質（例如水樣或土壤樣品）而定。

4.4 檢測對象自身因素

目標物種的個體大小、攝食及繁殖等活動都會影響環境DNA在水環境中的濃度。Klymus[59]等研究入侵物種鰱和鳙發現調查物種的環境DNA脫落率與生物量呈正相關，且攝食行為會增加它們的環境DNA脫落量。Nicholas[60]等研究生物量、性別比以及行為對美國小龍蝦環境DNA釋放量的影響時，發現美國小龍蝦在產卵期的環境DNA濃度顯著提高，其環境DNA檢出率可能較平常而言更高，這可能是調查物種在產卵期產生了大量的分泌物（配子、血液和排泄物等）釋放于水體所致，因此在進行定量分析時采樣應考慮目標物種的繁殖周期，以最大限度地提高檢測和推斷目標物種密度的準確性。Maruyama[61]等研究表明藍鰓太陽魚的環境DNA釋放量與物種質量呈正相關，但幼魚組的釋放率略高于成魚組，這可能是個體代謝率下降所致。此外，其他人類活動或食魚鳥類等也會導致水生生態系統中出現外來物種的DNA，從而影響環境DNA技術的檢測結果[62]。

5 環境DNA的未來發展方向

5.1 結合空間分析

在使用環境DNA技術調查水生外來動物入侵物種時，往往不僅關注其有無入侵和生物量，其空間分布范圍和潛在入侵地也通常受人關注。有研究表明，將環境DNA技術與統計模型結合可有效協助入侵物種環境DNA的調查。Riaz[63]等將環境DNA與物種空間分布預測模型相結合，精準監測了引入物種牛鱒的分布情況，同樣在泥鰍和小口黑鱸等入侵物種上也取得了不錯的效果[64-65]。此外，還可以結合遙感技術等，從更大尺度揭示入侵范圍或者潛在入侵。這些空間分析和模型能改進環境DNA的可探測性，增加環境DNA技術檢測結果的精準度，還能在空間上進行預測和分析，是未來的一大研究方向。

5.2 檢測設備研發

隨著其他研究手段的發展和更新，便攜式的設備和更快速的檢測則可以有利于環境DNA技術的運用和推廣。環境DNA小型便攜式儀器以及全自動化取樣和分析裝置是未來的一大發展方向。目前已有一些設備出現，例如便攜式qPCR儀和納米孔測序儀等，可用于環境DNA的現場分析，避免樣品在保存和帶回實驗室途中出現交叉污染以及環境DNA降解，也拓寬了環境DNA技術在復雜水域環境下的應用[41]，但目前市面上還沒有一套完善的有針對性的檢測裝置。

跨學科技術結合也為監測入侵物種開辟了新思路。例如，Egan[66]等利用 LTS（Light Transmission Spectroscopy）與環境DNA技術結合在美國印第安納港口附近檢測到了斑馬貽貝，實現了對壓艙水和港口水域中入侵物種的快速檢測。這些技術的結合，為環境DNA的檢測提供更多的可能。

6 結束語

環境DNA技術作為入侵物種早期檢測的工具十分靈敏且極具潛力，能在不干擾其他水生動物的情況下對入侵物種進行有效跟蹤[67-68]。目前，環境DNA技術雖然已經在該領域得到了一定發展，但仍需要更多地實踐以及其他技術的合作來提高環境DNA檢測的可靠性。未來，不僅在技術層面，需進一步改進環境DNA分析標準化（包括規范采樣方案，開發高分辨率引物，提高本地物種數據庫有效性和完整性等）；在研究手段上，也需要整合包括人工智能、大數據和遙感技術等跨學科研究手段，最終實現大尺度和智能化的檢測。