八味沉香散對缺血再灌注損傷心肌細胞SOD、MDA和凋亡影響的研究

徐 冰，角 加，聶 波

（1.中國藏學研究中心北京藏醫院 中醫科，北京 100029；2.北京中醫藥大學東直門醫院/中醫內科學教育部暨北京市重點實驗室，北京 100700）

缺血性心臟病對人類健康造成嚴重危害，在治療缺血性心臟病的過程中，缺血后再灌注反而使原缺血區組織損傷加重。研究心肌缺血再灌注損傷（MIRI）的機制并尋求抗MIRI 有效藥物和方法尤為重要[1-2]。藏藥八味沉香散臨床觀察對冠心病心絞痛效果顯著，是治療心血管疾病常用藏藥之一。本研究以大鼠心肌細胞H9C2 為靶細胞，探討八味沉香散對缺血再灌注損傷心肌細胞中SOD 活性、MDA 水平以及細胞凋亡的影響，研究其保護心肌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞 大鼠心肌細胞H9C2（購自中國科學院細胞庫，貨號GNR 5）。

1.2 主要試劑 完全培養基（ECM）的配置：含10%特級胎牛血清（杭州四季青，貨號13011-8611），90%高糖DMEM（貨號12100）；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（貨號T1300），PBS 磷酸鹽緩沖液（貨號P1010），細胞級DMSO（貨號8371），均購自北京索萊寶科技有限公司；有糖Earles 液（貨號CC0042），無糖Earles 液（貨號X0942），均購自Leagene。超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（貨號A001-3）、細胞丙二醛（MDA）測試盒（貨號A003-4），均購自南京建成生物工程研究所；八味沉香散（西藏神猴藥業）；曲美他嗪（HY-B0968），購自MCE 公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（貨號P0012），細胞凋亡－Hoechst染色試劑盒（貨號C0003），均購自碧云天生物技術有限公司。

1.3 主要儀器 倒置相差顯微鏡（Olympus IMT-2）、徠卡倒置熒光顯微鏡（DM IL LED）、CO2培養箱（MCO-20AIC，SANYO 公司）、低氧CO2培養箱（MiniGalaxy A，RS biotech 公司）、超凈工作臺（ESCO公司）、臺式滅菌器（T4 0R3250）、純水機（GN-RO-40）、電熱恒溫水箱（HH.W21.420）、低速離心機（LD4-2）、全自動酶標儀（Clinic bio 128C）。

1.4 實驗方法

1.4.1 復制缺血再灌注體外模型 H9C2 細胞正常培養：將H9C2 細胞懸液以每平方厘米8 000 個接種至培養瓶中，CO2培養箱（95%空氣，5%CO2）中貼壁培養，第2 天更換ECM 以去除殘留的DMSO 和未貼壁的細胞，隔2 天換液1 次。至細胞大約90%融合時傳代，以PBS 漂洗2 遍，按40 μL/cm2加入0.25%胰酶消化液，約1 min 后鏡下觀察細胞變圓，震動瓶壁至細胞脫落，按1:2 體積立即加入ECM 終止消化，收集細胞混懸液，1 000 rpm 離心5 min，棄液，將細胞團重新混懸，細胞計數，以104個/孔種入96 孔板正常培養，待細胞85%融合時造模。分組造模：以缺糖缺氧模擬缺血，復糖復氧模擬再灌注。設正常組、缺氧2 h、4 h、6 h 組，每組設6 個復孔。正常組，缺氧時用有糖Earles 液，再灌時換ECM，始終在正常條件下培養。模型組，缺氧時用無糖Earles 液，低氧CO2培養箱（37℃，5%CO2，1%O2）中分別培養2 h、4 h、6 h，再用ECM 在CO2培養箱正常培養24 h。造模結束以cck8 法檢測各組細胞增殖情況，每孔加CCK8 10 μL 和ECM 100 μL，37 ℃孵育1 h，酶標儀測定450 nm 各孔吸光度（OD）值。

1.4.2 八味沉香散提取物（水提）對心肌細胞SOD、MDA 水平的影響 將細胞以2.5×104/cm2接種于60 mm培養皿中，待細胞85%匯合時造模，方法同1.4.1。實驗分組：正常組，有糖Earles 液培養4 h，更換ECM培養24 h，均在CO2培養箱中培養；缺血再灌注組（I/R 組），低CO2培養箱中以無糖Earles 液培養4 h，更換ECM 于CO2培養箱中培養24 h；I/R ＋八味沉香散提取物（水提）高、中、低劑量組，在造模前1 h及I/R 時加入相應濃度（240、120、60 ug/mL）的八味沉香散提取物；D.曲美他嗪對照組：在造模前1 h 及I/R 時加入240 ug/mL 的曲美他嗪。

造模結束后，胰酶消化收集細胞團于ep 管中。1）細胞破碎：加1 mL PBS 混勻，1 000 r/min 離心10 min，留細胞沉淀，再加0.5 mL PBS，以冰水浴超聲破碎，每5 s 超1 次，間隔4 次，每次間隔30 s。2）蛋白濃度測定：加入按梯度稀釋的標準品、等體積樣品于96孔板中，每個樣本和標準品均設復孔，各孔加入200 μL BCA 工作液，37 ℃ 20 min，測定562 nm 的吸光度，根據標準曲線和使用的樣品體積計算蛋白濃度。3）測定SOD 活力：設對照孔（20 μL 蒸餾水+20 μL酶工作液）、對照空白孔（20 μL 蒸餾水+20 μL 酶稀釋液）、測定孔（20 μL 樣本+20 μL 酶工作液）、測定空白孔（20 μL 樣本+20 μL 酶稀釋液），各孔均加入底物應用液200 μL，混勻，37℃孵育20 min，測定A450 值。SOD 抑制率（%）=[（A對照-A對照空白）-（A測定-A測定空白）]/（A對照-A對照空白）×100%，SOD活力（U/mgprot）=SOD 抑制率/50%×（反應體系/稀釋倍數）/待測樣本蛋白濃度（mgprot/mL）。4）測定MDA 含量：造模結束后，于細胞團加0.5 mL 提取液，冰水浴超聲破碎成懸液樣本。設空白管（無水乙醇）、標準管（10 nmol/mL 標準品）、樣品管各取100 μL 均加入1 mL MDA 工作液，混勻，95℃水浴40 min，流水冷卻，4 000 r/min 離心10 min，取250 μL 反應液加入96 孔板中，530 nm 測吸光度。MDA含量（nmol/mgprot）=（OD測定-OD空白）/（OD標準-OD空白）×標準品濃度（10 nmol/mL）/樣本蛋白濃度（mgprot/mL）。

1.4.3 八味沉香散提取物（水提）對心肌凋亡的影響 取潔凈蓋玻片在75%乙醇中浸泡5 min，無菌PBS 洗滌3 遍，再用ECM 洗滌1 遍，將蓋玻片置于24 孔板內，按2.5×104/cm2接種細胞，約為80%滿時造模。實驗分組及造模方法同1.4.2。實驗結束后，吸盡培養液，加入0.5 mL 固定液，固定10 min，PBS 洗2 遍，每次3 min。加0.5 mL Hoechst 33258 染色液，染色5 min，PBS 洗2 遍，每次3 min。滴1 滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，熒光顯微鏡激發波長350 nm，發射波長460 nm 觀察照相。

1.5 統計學方法 半定量結果用image J 軟件對圖象進行灰度分析。數據以均數±標準差（）表示，用SPSS 17.0 統計軟件進行分析。組間比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA），最小顯著差法（LSD）進行兩兩比較，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 H9C2 缺血再灌注損傷模型構造 細胞形態特征變化：倒置顯微鏡下觀察正常組細胞呈多個小島樣克隆，胞體肥厚、透明，菱形或多角形，略長，核小而圓，呈鋪路石樣，展開貼壁，形態無明顯改變。體外模擬缺血，2 h 后模型組細胞稍有回縮，4 h 后模型組大量細胞回縮變瘦長，間隙變大，部分漂浮，折光性增強，6 h 后模型組細胞大部分漂浮，細胞成膜狀脫落，細胞破裂，細胞膜完整性破壞。如圖1。缺血再灌注模型細胞增殖活性：不同時間缺氧再灌注對H9C2 細胞增殖活性OD 值，正常組（1.28±0.10），缺氧2 h 組（1.07±0.15），缺氧4 h 組（0.64±0.12），缺氧6 h組（0.37±0.38），可見體外模擬缺糖缺氧2 h、4 h、6 h 再灌注24 h 的各模型組體現細胞增殖活性的OD 值均低于正常組（P＜0.01）。說明缺血2 h 時，細胞已出現損傷，隨缺氧時間延長，OD值下降，活細胞數減少，在6 h 細胞破損嚴重。故選取4 h 缺氧24 h 再灌注造模。

圖1 H9C2 不同時間缺血再灌注損傷模型（X100）

2.2 各組H9C2 細胞SOD 活力和MDA 濃度比較 見表1。

表1 各組H9C2細胞SOD活力和MDA濃度比較（，n=6）

表1 各組H9C2細胞SOD活力和MDA濃度比較（，n=6）

注：與模型組比較，# P ＜0.05，# # P ＜0.01；與正常組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

2.3 八味沉香散提取物（水提）對心肌凋亡影響 熒光鏡下觀察：細胞發生凋亡時，染色質會固縮。Hoechst 33258 染色后，在熒光顯微鏡下觀察，正常細胞的細胞核顏色偏淡，細胞核體積較大，形狀較均一，而凋亡細胞的細胞核會呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色發白，細胞核體積較小，形狀不均一，大小不等。正常組有極少量細胞核致密濃染，模型組有大量致密或碎塊狀的濃染細胞核，曲美他嗪組和八味沉香散各劑量組濃染細胞核較缺氧組明顯減少。見圖2。半定量圖像分析：模型組平均光密度明顯增高，與正常組比較有顯著性差異（P＜0.01）。與模型組比較，曲美他嗪和八味沉香散的平均光密度顯著低于模型組（P＜0.01），表明八味沉香散能夠很好抑制MIRI 損傷造成的細胞凋亡，且藥效隨濃度升高增強。見表2。

圖2 各組H9C2 細胞凋亡熒光染色

表2 各組H9C2 細胞凋亡水平陽性表達面積、光密度和平均光密度表（，n=6）

表2 各組H9C2 細胞凋亡水平陽性表達面積、光密度和平均光密度表（，n=6）

注：與模型組比較，# # P ＜0.01；與正常組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

3 討論

MIRI 導致大量活性氧自由基生成已被研究證實[3-4]。活性氧自由基所致的氧化損傷可以導致很多疾病的發生，而抗氧化防御系統是保護機體免受損害的重要屏障[,5-6]。研究表明，正常機體內的氧化/抗氧化系統處于動態平衡狀態，過剩的活性氧自由基被機體正常的抗氧化防御系統清除；在受到MIRI 刺激后，線粒體電子傳遞鏈可以釋放出大量活性氧自由基，機體清除力不足，使氧化/抗氧化系統的平衡狀態被打破，引發氧化應激反應[7-8]。活性氧自由基可以與細胞膜的不飽和脂肪酸和膽固醇結合，發生脂質過氧化反應，產生脂質過氧化物（MDA），使細胞膜流動性下降而通透性增高，能間接反應自由基對機體的損傷程度[9-10]。SOD 是體內氧自由基清除系統的主要酶，除此外還有過氧化氫酶（GSHPx）、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化物酶、維生素C、維生素E 等，SOD 可以催化O2-歧化反應，生成氧化活性相對較弱的H2O2，并繼續在過氧化氫酶和GSHPx 的催化下轉化成水，其水平的高低可反映機體清除自由基的能力[11-12]；兩者常共同檢測以評價機體抗氧化能力/氧化損傷程度[13]。活性氧自由基誘發細胞凋亡的途徑主要有2 種：1）直接誘導細胞凋亡。細胞膜的脂質過氧化反應，使蛋白質肽鍵斷裂，受體蛋白酶、通道蛋白等膜蛋白分布紊亂，誘導細胞凋亡[14]；產生的脂質過氧化物和OH 也能直接損傷DNA，影響DNA 的穩定，使DNA 斷裂，導致細胞凋亡[15-16]；2）間接誘導細胞凋亡。活性氧通過影響線粒體呼吸鏈、細胞內的鈣離子等，影響信號轉導與基因表達，誘發細胞凋亡[17]。

本研究中，缺氧再灌注損傷后大鼠心肌細胞的MDA 濃度明顯升高，SOD 活力降低，而八味沉香散提取物（水提）能有效抑制MIRI 造成的MDA 濃度升高，使SOD 活力保持在較高水平，減輕細胞的氧化損傷。本研究通過細胞實驗證明，缺氧再灌注損傷使心肌細胞的凋亡水平明顯增加，八味沉香散提取物（水提）能夠明顯抑制MIRI 造成的細胞凋亡。綜合實驗結果，推測八味沉香散的抗缺氧再灌注損傷作用，是通過減少應激狀態下活性氧化自由基的形成，減少脂質過氧化物生成，提高抗氧化能力如SOD 活力，阻斷由其誘發的細胞凋亡的直接和間接途徑，達到保護心肌細胞作用的。

藏藥八味沉香散記載于《四部醫典》中，由沉香、肉豆蔻、廣棗、石灰華、木棉花、乳香、木香和訶子等8 味藏藥組成，具有養心安神、理氣開竅、行氣活血等功效。本研究顯示，八味沉香散能夠通過提高心肌細胞的抗氧化能力，減少缺血再灌注損傷氧化物的生成，抑制細胞凋亡，保護心肌細胞，為藏醫獨特組方理論、藏藥高抗缺氧作用提供了切實的實驗依據，具有廣闊的應用前景和社會價值。