亞甲藍介導光動力抗菌化學治療改善糖尿病下肢潰瘍感染的初步臨床研究

王久香，程慶豐，朱深銀，陳歡歡，杜志鵬，唐紫薇

糖尿病下肢潰瘍（diabetic lower extremity ulcer）是糖尿病患者一種常見的并發癥，指下肢神經病變和不同程度的血管病變導致的下肢出現創面破潰、感染和/或深層組織破壞［1］。細菌感染是導致糖尿病下肢潰瘍遷延不愈甚至截肢的最主要原因［2］。大多數糖尿病下肢潰瘍感染為多種微生物引起的混合感染，包括需氧革蘭陽性球菌、革蘭陰性桿菌、真菌和厭氧菌［3］。目前糖尿病下肢潰瘍感染通常在糖尿病基礎治療上實施系統性抗感染治療，然而多數糖尿病下肢潰瘍患者存在下肢動脈粥樣硬化病變及灌注不足，全身用抗菌藥物難以在下肢潰瘍局部達到有效的治療濃度，致使全身用抗菌藥物果有限，且易出現多藥耐藥菌［4］。若感染未得到有效控制，潰瘍創面可能會形成細菌生物膜，減少抗生素的滲透，進一步降低抗菌藥物療效，導致創面愈合遲緩［5］。因此，亟須開發一種具備新作用方式的抗菌治療方法，以改善糖尿病下肢潰瘍感染的治療結局。

光動力抗菌化學治療（photodynamic antimicrobial chemotherapy，PACT）為一種光輻照誘導局部微生物滅活的化學治療方法［6］。PACT殺菌作用機制與傳統的抗菌藥作用不同，主要是通過特定波長的光照射，光敏劑吸收該波長的光能而處于激發狀態，將能量傳遞給局部組織分子氧，作用后產生大量活性氧（單線態氧、超氧陰離子和氧自由基），作用于細菌細胞壁、細胞膜以及核酸等靶點，可殺滅抗生素敏感菌及耐藥細菌，且不易產生細菌耐藥。活性氧存在時間極短，局限在局部組織，利于局部治療，不損傷周圍組織［7］。有研究報道大部分光敏劑介導的PACT能對革蘭陽性菌產生殺菌作用；而對于革蘭陰性菌，只有陽離子光敏劑介導的PACT才能起到較好殺菌作用［8］。因此，陽離子光敏劑是廣譜PACT所必需的。亞甲藍（methylene blue，MB）作為陽離子光敏劑，很容易與革蘭陰性菌脂多糖的負電荷結合，而革蘭陽性菌胞質膜外只有莢膜物質和肽聚糖，因此，MB能輕易滲透通過革蘭陰性菌和革蘭陽性菌的細胞壁、細胞膜，可作為廣譜殺菌光敏劑。ASPIROZ等［9］報道用1% MB介導紅光照射能起到快速、廣譜的殺菌效果，且無不良反應。然而目前通過光敏劑MB介導PACT作為一種輔助全身治療方法改善糖尿病下肢潰瘍感染的隨機對照臨床研究罕見報道。因此，本研究采用隨機對照研究初步探究MB介導PACT對糖尿病下肢潰瘍感染的療效及安全性，以探索一種糖尿病下肢潰瘍感染患者的新的、適宜性輔助治療方法，為改善糖尿病下肢潰瘍感染患者治療結局提供依據和參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年3月—2020年2月在重慶醫科大學附屬第一醫院內分泌科住院的糖尿病下肢潰瘍感染患者為研究對象。糖尿病下肢潰瘍感染的診斷依據為糖尿病患者下肢出現潰瘍創面炎癥表現［10］。糖尿病下肢潰瘍嚴重程度根據Wagner分級系統進行分級［11］。糖尿病下肢潰瘍創面按照國際糖尿病足工作組（IWGDF）和美國感染病學會（IDSA）的分級方法進行分級［3］（PEDIS分級）。納入標準：（1）年齡18～80歲；（2）糖尿病病史在3個月以上；（3）治療前1周內測定的潰瘍創面標本細菌培養總細菌量＞104集落形成單位（CFU/ml），單個潰瘍的最大直徑＜10 cm、面積＜100 cm2；（4）下肢潰瘍創面PEDIS分級2級或糖尿病足Wagner分級2級；（5）自愿參加本研究。排除標準：（1）出現嚴重膿毒癥；（2）需要立即進行下肢血運重建，踝肱指數＜0.5；（3）孕婦或哺乳期女性；（4）對MB及其溶劑過敏；（5）有其他嚴重疾病如心臟病和肝腎功能不全等。退出標準：（1）在治療過程中發生全身嚴重感染；（2）需要行下肢截肢；（3）出現其他嚴重的影響受試者健康和生命的疾病；（4）受試者撤除知情同意書。本研究所有受試者簽署知情同意書，并經重慶醫科大學附屬第一醫院倫理委員會批準（科研倫理批件2020-239）。

1.2 分組及治療 根據計算機產生的隨機數字表將研究對象分為試驗組和對照組，各15例。所有患者根據相關診療指南進行常規的降糖、抗菌、調脂、改善血液循環等標準治療。試驗組治療方法：潰瘍創面外涂1%MB溶液，避光孵育30 min，光子治療儀照射20 min〔普門公司，Carnation-11，波長（640±10）nm，總光能48 J/cm2〕，1次/d，連續治療7 d。對照組治療方法：在潰瘍創面外涂0.9%氯化鈉溶液，光照處理同試驗組。

1.3 潰瘍創面PEDIS分級及面積測量 患者分別于治療前、治療7 d后進行PEDIS分級；用數據照相機進行潰瘍創面拍照，用Image J 軟件3.0（National Institutes of Health）計算創面面積［12］。潰瘍創面PEDIS分級與面積計算由設盲的非光動力治療的研究者實施。

1.4 潰瘍創面標本細菌負荷檢測 將患者潰瘍創面先用無菌0.9%氯化鈉溶液沖洗，后將一根用0.9%氯化鈉溶液浸濕的無菌拭子在潰瘍創面表面擦拭，然后放入裝有1 ml 0.9%氯化鈉溶液的無菌試管中，倍數稀釋后，將0.1 ml稀釋后不同濃度的接種液均勻接種到血瓊脂板上，進行標準細菌培養 24 h，根據平板上的菌落數計算潰瘍創面細菌負荷（CFU/ml）［13］。

1.5 觀察指標

1.5.1 人口學特征和臨床特征 收集患者的人口學特征和臨床特征，包括年齡、性別、體質指數（BMI）、糖尿病病程、糖化血紅蛋白（HbA1c）、糖尿病周圍神經病變發生情況、糖尿病血管病變發生情況、糖尿病腎病發生情況、糖尿病視網膜病變發生情況、潰瘍部位、潰瘍面積、潰瘍病程、潰瘍創面細菌類型、抗菌藥物使用強度。

1.5.2 療效指標 主要終點指標：潰瘍創面細菌負荷（CFU/ml），分別于治療前及治療后即刻、治療4 d后、治療7 d后檢測并記錄。

次要終點指標：全身抗菌藥物使用強度〔累計用藥頻度（DDDs）〕、潰瘍創面PEDIS分級、潰瘍面積（cm2）、血常規及C反應蛋白（C-reactive protein，CRP），于治療前和治療7 d后測定并記錄。

1.5.3 治療安全性觀察 每天記錄治療過程中兩組患者潰瘍光照區域是否有紅斑、水腫、水泡等不良反應及MB相關的全身過敏反應。

1.6 統計學方法 采用SPSS 24.0軟件進行數據分析。采用K-S檢驗樣本的正態性，計量資料中符合正態分布者以（±s）表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗；符合偏態分布者以M（P25，P75）表示，兩組比較采用非參數檢驗；計數資料以相對數表示，兩組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者人口學特征和臨床特征及全身抗菌藥物使用強度比較 兩組患者年齡、性別、BMI、糖尿病病程、HbA1c、糖尿病周圍神經病變發生率、糖尿病血管病變發生率、糖尿病腎病發生率、糖尿病視網膜病變發生率、潰瘍部位、潰瘍面積、潰瘍病程、潰瘍創面細菌類型、抗菌藥物使用強度（累計DDDs）比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表1）。

表1 兩組患者人口學特征和臨床特征比較Table 1 Demographics and clinical characteristics in two groups

2.2 MB介導PACT對患者潰瘍創面炎癥及面積的影響 試驗組患者在治療1周后潰瘍創面周圍炎癥紅腫消退，潰瘍創面膿性分泌物減少，潰瘍床由黃期轉為紅期，而對照組潰瘍創面炎癥沒有明顯變化（見圖1）。

圖1 MB介導PACT對糖尿病下肢潰瘍感染患者的治療情況Figure 1 Effect of methylene blue-mediated photodynamic antimicrobial chemotherapy on diabetic lower extremity ulcer infection

治療前兩組患者潰瘍創面PEDIS分級均為2級，治療7 d后試驗組潰瘍創面PEDIS分級由2級轉為1級9例（9/15），而對照組潰瘍創面PEDIS分級無變化。兩組患者治療前、治療7 d后潰瘍面積（組間、組內）比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表2）。

表2 兩組患者治療前及治療7 d后潰瘍面積比較〔M（P25，P75），cm2〕Table 2 Wound area before and after 7-day treatment in two groups

2.3 MB介導PACT對患者血常規及CRP的影響 兩組患者治療前、治療7 d后白細胞計數、中性粒細胞計數、中性粒細胞分數、血小板計數、血紅蛋白比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；兩組患者治療前、治療7 d后CRP比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；試驗組患者治療7 d后CRP低于治療前，差異有統計學意義（P＜0.05，見表3）。

表3 兩組患者治療前及治療7 d后血常規及CRP比較Table 3 Routine blood test results and serum CRP before and after 7-day treatment in two groups

2.4 MB介導PACT對患者潰瘍創面細菌負荷的影響兩組患者治療前和治療后即刻潰瘍創面細菌負荷比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；試驗組患者治療4、7 d后潰瘍創面細菌負荷低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；試驗組患者治療后即刻和治療4、7 d后潰瘍創面細菌負荷低于治療前，差異有統計學意義（P＜0.05）；對照組患者治療4、7 d后潰瘍創面細菌負荷低于治療前，差異有統計學意義（P＜0.05，見表4）。

表4 兩組患者不同治療時間潰瘍創面細菌負荷比較（±s，CFU/ml）Table 4 Bacterial counts in the ulcer before and immediately，4 and 7 days after treatment in two groups

表4 兩組患者不同治療時間潰瘍創面細菌負荷比較（±s，CFU/ml）Table 4 Bacterial counts in the ulcer before and immediately，4 and 7 days after treatment in two groups

注：兩組數據為經lg轉化后數據；與治療前比較，aP＜0.05

組別 例數 治療前 治療后即刻 治療4 d后 治療7 d后對照組 15 6.5±1.3 6.2±1.3 5.1±1.4a 3.7±1.6a試驗組 15 7.4±1.4 5.5±1.0a 3.1±1.0a 1.8±0.3a t值 -1.768 1.618 4.550 4.550 P值 0.088 0.117 ＜0.001 ＜0.001

2.5 MB介導PACT的不良反應發生情況 試驗組和對照組患者在治療過程中均未出現任何與光照和MB相關的輻照區域紅斑、腫脹、疼痛、瘙癢等不良反應。

3 討論

促進創面愈合是治療糖尿病下肢潰瘍感染亟須解決的問題，相關指南推薦糖尿病下肢潰瘍感染治療的原則是內科治療結合外科治療，其中內科治療包括通過加強患者教育、個體化調整胰島素或降糖藥的用量嚴格控制血糖，改善血液循環，全身抗感染治療；外科治療包括清創、引流、減壓等［14］。然而，糖尿病下肢潰瘍感染因潰瘍創面血流灌注不足、細菌耐藥及生物膜形成給臨床在糖尿病標準治療基礎上進行全身抗菌治療帶來了不少挑戰，亟須探索一種新的局部輔助滅菌治療方法以減輕創面感染，促進創面愈合。本研究利用已在臨床使用的光敏劑MB介導PACT聯合糖尿病下肢潰瘍常規治療，觀察其對潰瘍創面細菌負荷、炎癥的影響，結果顯示MB介導PACT可以改善糖尿病下肢潰瘍感染，且具有良好的安全性。

PACT殺菌機制不同于抗菌藥，主要通過光敏劑吸收光能產生大量活性氧（單線態氧、超氧陰離子和氧自由基）而滅活細菌，抗菌譜廣，能夠殺滅耐藥菌，且不會產生細菌耐藥。MB是臨床常用生物染色劑和示蹤劑，最大吸收波長為664 nm，可被光子治療儀發射波長所激發，介導PACT。本研究結果顯示，與治療前相比，試驗組治療后即刻潰瘍創面細菌負荷明顯減少，表明MB介導PACT具有較強的快速殺菌效果。MORLEY等［15］報道光敏劑PPA904介導光動力治療組治療后即刻細菌負荷明顯減少（P＜0.05），而對照組治療前后細菌負荷沒有明顯差異。本研究進一步觀察MB介導PACT治療4、7 d后潰瘍創面細菌負荷情況，結果顯示試驗組患者潰瘍創面細菌負荷均明顯低于對照組。MONAMI等［16］報道光敏劑RLP068介導光動力治療2周后，50%患者的細菌負荷＜103CFU/ml，表明RLP068介導PDT在治療2周后具有較好的殺菌效果。但是，本研究中試驗組與對照組治療7 d后潰瘍創面細菌負荷明顯降低〔（1.8±0.3）和（3.7±1.6）〕CFU/ml。光敏劑介導抗菌持續效應不同的原因可能與使用的光敏劑特性及輻照方案不同有關。兩組患者在治療過程中常規全身使用抗菌藥物進行治療，但兩組間抗菌藥物使用強度無差異；表明MB介導PACT治療能明顯降低糖尿病下肢潰瘍感染患者潰瘍創面細菌負荷。

潰瘍感染創面的炎癥及全身炎癥相關指標主要由潰瘍創面細菌負荷所決定。本研究中MB介導PACT治療7 d后潰瘍創面PEDIS分級降低（9/15），分泌物減少，潰瘍床由黃期轉為紅期，顯示MB介導PACT治療通過直接殺滅細菌、降低創面細菌負荷、減輕潰瘍創面炎癥、促進創面新生肉芽組織生長而促進創面愈合。血常規及CRP為臨床常用的反映全身炎癥的指標［17］，本研究結果顯示試驗組治療7 d后CRP明顯降低，但對白細胞計數及中性粒細胞計數沒有影響，可能與本研究納入的受試者潰瘍感染較輕，而CRP對炎癥較血常規更敏感有關。本研究兩組患者治療后潰瘍面積沒有明顯的差異，可能原因是治療時間較短（只觀察了7 d）而潰瘍愈合需要一定時間；加之樣本量較少，未能進一步評估更長時間MB介導PACT對糖尿病下肢潰瘍愈合的改善效果。

以上結果顯示MB介導PACT具有較好的殺菌、減輕炎癥、促進創面愈合的作用，但本研究尚未對其機制進行研究，根據相關文獻報道，其機制可能與以下幾個方面有關：首先，MB介導PACT減少創面細菌負荷，不僅可減輕感染還可清除創面愈合的障礙，進而促進創面愈合［18］；其次，PACT可能通過免疫調節和促進生長因子的生成而促進創面愈合［19-20］。但目前尚無基礎研究充分闡明相關機制，有待進一步深入研究。

綜上所述，糖尿病下肢潰瘍感染患者在常規標準治療基礎上進行MB介導PACT可有效殺滅潰瘍創面細菌、降低潰瘍創面細菌負荷、減輕潰瘍局部炎性反應、促進肉芽組織生長，進而改善糖尿病下肢潰瘍創面感染，且有良好的安全性，可為糖尿病下肢潰瘍感染提供新的輔助治療依據，有望成為糖尿病下肢潰瘍感染治療的一種有前景的方法。但還需要進一步大樣本臨床試驗來驗證其臨床療效及深入研究其作用機制。

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光動力治療（PDT）指通過特定波長的光照射，光敏劑吸收該波長的光能而處于激發狀態，將能量傳遞給局部組織分子氧，作用后產生大量活性氧（單線態氧、超氧陰離子和氧自由基），進而誘導細胞凋亡的過程。PDT的三要素是光敏劑、特定波長的光、組織分子氧。PDT已廣泛應用于癌癥（包括皮膚癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、頭頸癌）和非癌性疾病、類風濕關節炎（RA）、銀屑病、尋常性痤瘡等。光動力抗菌化學治療（PACT）是一種光輻照誘導局部微生物滅活的化學治療方法，也是一種不依賴于局部血供的非特異性抗菌療法，不易產生耐藥菌，不損傷周圍組織，因此，PACT被認為是一種有前景的治療慢性感染的方法。目前PACT廣泛用于尖銳濕疣、口腔牙菌斑生物膜、痤瘡丙酸桿菌、燒傷感染等。

本研究局限性：

（1）樣本量較小；（2）觀察時間有限，未觀察到亞甲藍（MB）介導PACT對潰瘍創面的長期影響；（3）未對MB-PACT減輕潰瘍創面炎癥，促進潰瘍創面愈合的機制進行研究。

作者貢獻：王久香、朱深銀負責文章的構思與設計、論文的撰寫和修訂；王久香、程慶豐負責研究的實施與可行性分析、結果分析與解釋，對文章整體負責、監督管理；王久香、杜志鵬進行數據收集；王久香、陳歡歡進行數據整理；王久香、唐紫薇負責統計學處理；王久香負責文章的質量控制及審校。

本文無利益沖突。