血漿SEPT9甲基化檢測對結直腸癌診斷價值的臨床研究

吳秀方，南瓊，張曉紅，耿婷，陳紫紅

結直腸癌（CRC）是消化系統常見的惡性腫瘤之一，在全世界范圍內具有較高的發病率和死亡率，自20世紀90年代初以來，其在年輕人中的發病率幾乎增加了1倍［1］。CRC早期的臨床表現不典型，多數患者就診時已錯過了最佳手術時機，且發生遠處轉移患者的5年生存率僅為10%左右［2］，因此盡早發現結直腸的癌前病變和早期癌變并積極進行干預對降低CRC的病死率十分重要。

在先前的研究中已報道了幾種基于DNA甲基化的CRC生物標志物，其中SEPT9甲基化（mSEPT9）被認為是檢測CRC有前途的標志物之一［3］。SEPT9位于染色體17q25.3處，可編碼在細胞代謝中發揮重要作用的SEPT9蛋白，而該蛋白能夠防止細胞過快分裂或以不受控制的方式增殖，具有抑癌作用，當SEPT9啟動子區域甲基化時，可阻止SEPT9蛋白表達，從而導致CRC的發生發展［4］。在CRC發生和發展過程中，mSEPT9 DNA從壞死性和凋亡性癌細胞釋放到外周血中，因此，可以通過檢測外周血SEPT9特定啟動子區域的DNA甲基化程度來確定CRC發生風險。本研究檢測了患者血漿mSEPT9與血清癌胚抗原（CEA），對二者在早期癌和進展期癌患者中的陽性率進行對比分析，并探討了二者聯合檢測對CRC的診斷價值，以期尋找出一種能早期發現CRC的無創、簡便、有效的檢測方法。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2017年12月—2018年12月在昆明醫科大學第一附屬醫院消化內科、胃腸外科及腫瘤科就診的患者272例。納入標準：（1）于結腸鏡檢查前及術前采集血標本；（2）經結腸鏡或術后病理檢查確診；（3）病歷資料完整。排除標準：（1）妊娠期或哺乳期婦女；（2）合并其他惡性腫瘤或有惡性腫瘤病史者；（3）有放療、化療治療史者；（4）有凝血功能障礙或血小板異常者；（5）檢測中的無效樣本。

1.2 樣本量估算 已知陽性檢出率公式用于樣本量估計：N=Z2×〔P（1-P）〕/E2。Z是一個統計參數（對于95%CI，Z=1.96），E代表誤差（在本研究中選擇0.1），P代表假定的陽性檢出率。本研究P代表SEPT9基因甲基化試劑盒對CRC的已知靈敏度，從先前的一項初步研究中獲得。如果已知靈敏度等于0.75，則至少需要72個CRC病例。本研究中納入CRC患者126例（早期癌72例、進展期癌54例）。

1.3 分組標準 以結腸鏡檢查及術后病理檢查結果作為金標準，對照組：結腸鏡檢查提示結直腸黏膜正常；腺瘤組：結腸鏡下息肉切除術后病理檢查結果提示管狀腺瘤、管狀-絨毛狀腺瘤；早期癌組：指癌變組織局限于黏膜層及黏膜下層，病理類型包括高級別上皮內瘤變、黏膜內癌、黏膜下癌；進展期癌組：病變侵及固有肌層及以下或發生遠處轉移。

1.4 分組 對照組82例，其中男47例、女35例，平均年齡（57.7±9.2）歲；腺瘤組64例，其中男37例、女27例，平均年齡（56.8±12.4）歲；早期癌組72例，其中男41例、女31例，平均年齡（56.1±12.3）歲；進展期癌組54例，其中男31例、女23例，平均年齡（58.1±12.6）歲。

1.5 血漿mSEPT9檢測和血清CEA檢測 采用SEPT9基因甲基化試劑盒（北京博爾誠科技有限公司）檢測血漿mSEPT9，按照試劑盒說明書進行血漿DNA提取、亞硫酸鹽轉化處理和PCR反應。試劑盒中提供了陽性和陰性對照，每一次檢測需要同時檢測陰、陽性對照。血清CEA檢測由昆明醫科大學第一附屬醫院檢驗科采用電化學發光法完成，參考值為5 ng/ml，血清CEA高于參考值為陽性。

1.6 統計學方法 采用SPSS 24.0統計軟件包進行數據處理和統計學分析。呈正態分布的計量資料以（±s）表示；計數資料以相對數表示，采用χ2檢驗；繪制血漿mSEPT9、血清CEA及二者聯合檢測診斷CRC的四格表，并分析其對CRC的診斷價值。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同臨床特征CRC患者血漿mSEPT9陽性率不同年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤最大直徑CRC患者mSEPT9陽性率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；早期癌患者血漿mSEPT9陽性率低于進展期癌患者，有淋巴結轉移患者血漿mSEPT9陽性率高于無淋巴結轉移患者，差異有統計學意義（P＜0.001，見表1）。

表1 不同臨床特征CRC患者血漿mSEPT9陽性率比較〔n（%），n=126〕Table 1 The relationship between mSEPT9 positive rate and different clinical characteristics of CRC patients

2.2 對照組、腺瘤組、早期癌組、進展期癌組患者血漿mSEPT9、血清CEA及二者聯合檢測的陽性率比較 對照組、腺瘤組、早期癌組和進展期癌組患者血漿mSEPT9、血清CEA及二者聯合檢測的陽性率比較，差異均有統計學意義（P＜0.001）。早期癌組和進展期癌組血漿mSEPT9、血清CEA及二者聯合檢測的陽性率均高于對照組和腺癌組（P＜0.05）；進展期癌組血漿mSEPT9、血清CEA及二者聯合檢測的陽性率高于早期癌組（P＜0.05）；對照組和腺瘤組各指標檢測陽性率間比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表2）。

表2 對照組、腺瘤組、早期癌組、進展期癌組患者血漿mSEPT9、血清CEA及二者聯合檢測結果分析〔n（%）〕Table 2 Results analysis of plasma mSEPT9，serum CEA and both in control group，adenoma group，early stage cancer group and progressing stage cancer group

2.3 血漿mSEPT9、血清CEA及二者聯合檢測結果分析 血漿mSEPT9、血清CEA及二者聯合檢測與金標準檢測結果見表3。血漿mSEPT9及血清CEA聯合檢測的靈敏度、準確度、陰性預測值高于單一指標檢測，血漿mSEPT9聯合血清CEA檢測與金標準診斷一致性檢驗，Kappa值為0.514（見表4）。

表3 血漿mSEPT9、血清CEA及二者聯合檢測對CRC的診斷結果（例）Table 3 Results analysis of plasma mSEPT9，serum CEA and the combination of the two compared to the gold standard

表4 血漿mSEPT9、血清CEA及二者聯合檢測對CRC的診斷價值Table 4 Diagnostic value of mSEPT9，serum CEA and their combined test for CRC

3 討論

本研究發現血漿mSEPT9的陽性率與CRC患者的年齡、性別、腫瘤部位及腫瘤最大直徑無關，與既往研究結果相似［5-6］。臨床上男性CRC的發病率高于女性，但本研究結果顯示mSEPT9檢測的陽性率在男性和女性之間沒有差異，表明兩性共享相似的SEPT9基因甲基化譜，而且CRC的發病機制也可能相似，男女患者均可以使用血漿mSEPT9診斷CRC。在CRC的發病部位中，結腸癌多于直腸癌［7］，但本研究顯示血漿mSEPT9陽性率在結腸和直腸之間沒有明顯差異，表明這兩個部位的腫瘤具有相似的發病機制，這一優勢對于從結腸和直腸中檢出病變至關重要，因為假如腸道準備不充分或患者不耐受，結腸鏡檢查可能會漏診一部分回腸末端和升結腸的癌癥，而糞便沿結腸運動時血紅蛋白降解，導致右側結腸糞便免疫化學測試（FIT）的檢出率低于左側結腸［8］，因此，結腸鏡和FIT在檢測右半結腸癌方面均顯示出不足，但采用血漿mSEPT9檢測則可在不同結直腸部位有效檢出CRC，這有助于其在CRC篩查中的應用。目前仍需要多中心、大樣本的數據進一步驗證血漿mSEPT9水平與腫瘤最大直徑的關系。

本研究顯示，對照組和腺瘤組患者血漿mSEPT9陽性率無明顯差異，提示該檢測不能有效鑒別出腺瘤患者。CHURCH等［9］進行的前瞻性研究顯示，血漿mSEPT9對晚期腺瘤的靈敏度僅為11.2%。考慮腺瘤檢出率較低是標志物向血液中釋放存在差異所致。本研究顯示，早期癌組患者血漿mSEPT9陽性率高于對照組，但其陽性率僅為33.3%，臨床意義較小，這限制了其對早期CRC和癌前病變（腺瘤）的鑒別能力。

本研究顯示，血漿mSEPT9患者的陽性率與腫瘤分期、有無淋巴結轉移有關。XIE等［10］的研究也顯示，血漿mSEPT9檢測對Ⅲ期和Ⅳ期患者的診斷靈敏度高于0期和I期患者，對有淋巴結轉移患者的診斷靈敏度高達85.71%。因此，與早期CRC患者相比，晚期CRC患者更容易檢測出血漿mSEPT9。分析早期CRC患者的血漿mSEPT9陽性率低的原因可能是早期CRC病灶通常較小，侵入性較小，將異常血漿mSEPT9 DNA釋放到血液中的機會較小。

血漿mSEPT9在CRC檢測中的診斷靈敏度在已發表的文獻中有所不同，對歐美人群的靈敏度為58%～95.6%，對亞洲人群的靈敏度為69%～88%［11-13］。本研究血漿mSEPT9檢測診斷CRC的靈敏度為57.14%，特異度為86.99%，靈敏度低于文獻報道，其可能由于以下幾個原因導致：首先，血漿mSEPT9檢測的陽性率與惡性程度呈正相關，晚期CRC患者血漿mSEPT9檢測陽性率高于早期CRC患者［14］，本研究納入了較多的早期癌患者（72/126），因此靈敏度較其他文獻報道偏低；其次，與目前大部分研究采用的Epi proColon2.0試劑盒不同，本研究采用的是國產簡化試劑盒，將PCR反應次數從2～3次簡化成1次，降低了檢測成本，且可減少算法對研究結果的影響，而張春燕等［15］采用同樣的試劑盒并以Ct值≤41.00為閾值，靈敏度為62.5%，特異度可高達90.0%，考慮可能與受檢者存在地區差異有關；最后，LEE等［16］發現韓國人群中血漿mSEPT9診斷CRC的靈敏度非常低，僅為36.6%，因此靈敏度差異可能部分歸因于人口統計學特征（性別、種族和年齡）、生活方式（吸煙和飲酒）、合并癥或其他環境暴露因素引起的樣本異質性。

本研究結果顯示，早期癌組患者血漿mSEPT9和血清CEA檢測的陽性率分別為33.3%和16.7%，二者聯合檢測的陽性率可提高至41.7%；進展期癌組患者血漿mSEPT9和血清CEA檢測的陽性率分別為88.9%和55.6%，二者聯合檢測的陽性率可達到100.0%。余南榮等［17］研究顯示CRC患者血漿mSEPT9聯合血清CEA檢測的陽性率為82.9%，較單獨血清CEA檢測的陽性率明顯升高。因此，聯合診斷在早期癌中和進展期癌中靈敏度均可進一步提高，這在早期癌篩查中有重要臨床意義，并為將來的CRC篩查提供了一種新方法，但仍需要擴大樣本量進行進一步研究。

綜上所述，血漿mSEPT9檢測單獨應用于鑒別腺瘤和早期癌價值有限，在早期和進展期CRC患者中，血漿mSEPT9檢測陽性率均高于血清CEA，二者聯合檢測的診斷價值可進一步提高，這在早期CRC篩查中有重要臨床意義。

作者貢獻：吳秀方進行文章的構思與設計，研究的實施與可行性分析，統計學處理，結果的分析與解釋，撰寫并修訂論文，對文章整體負責，監督管理；吳秀方、張曉紅、耿婷、陳紫紅進行數據收集、整理；南瓊負責文章的質量控制及審校。

本文無利益沖突。

本研究局限性：

血漿SEPT9甲基化（mSEPT9）檢測在進展期結直腸癌（CRC）患者中的陽性率高達88.9%，明顯高于血清癌胚抗原（CEA） 55.6%的陽性率，但其是否可能作為CRC療效評估和術后監測的指標還有待進一步研究。本研究對象并非均是無癥狀的平均風險人群。因此，在最終應用該檢測的前瞻性篩查環境中，其性能評估可能會有很大差異。一些重要的參數（例如患者依從性或成本效益）無法在本研究中進行評估。本研究選取的是2017—2018年的病例，研究結果可能存在局限性。