莪術油對人子宮內膜癌HEC-1-B細胞增殖、凋亡及Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響*

李偉宏，田莉，劉俊保

1.鄭州澍青醫(yī)學高等專科學校，河南 鄭州 450064；2.河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003

子宮內膜癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，且預后不良［1-2］。中藥誘導腫瘤細胞凋亡治療腫瘤是有效的治療手段，應用中藥治療腫瘤得到了廣泛的關注。莪術油有較好的抗腫瘤、抗炎、抗病毒、細胞凋亡［3-4］等作用；其主要有效成分為莪術酮、莪術二酮等。但關于莪術油對子宮內膜癌細胞的研究報道較少，本研究將探討莪術油對HEC-1-B細胞的增殖、凋亡及其可能的作用機制。

1 材料

1.1 細胞株和細胞培養(yǎng)HEC-1-B細胞株由上海歌凡生物科技有限公司提供。將細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基（10%胎牛血清）中，放入5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育［10］。

1.2 藥品及試劑DMEM培養(yǎng)基（美國康寧公司，批號：C2413118）；標準胎牛血清（standard FBS，天津灝洋生物制品科技責任有限公司，批號：20191230）；四甲基偶氮唑藍（methylthiazolyl tetrazolium，MTT，美國Sigma公司，貨號：88417）；DMSO（美國Amresco公司，貨號：472301）；Hoechst 33258染色劑（美國Sigma公司，貨號：BK17520）；Caspase-3、Bax與Bcl-2抗體（美國Cell signaling technology公司，貨號分別為：9622、5023、15071）；ECL化學發(fā)光液（碧云天生物技術有限公司，貨號：P0018AS）；莪術油注射液（徐州萊恩藥業(yè)有限公司，批號：H20067076）。

1.3 儀器倒置顯微鏡及照相裝置（日本Olympus公司）；CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）；SW-CJ-2FD型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；低速離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；MP200A型電子天平（上海精科天平）；DNM-9602G酶標分析儀（北京普朗新技術有限公司）；Mini-REPOTEANⅡ（Bio-Red公司）；DYY-Ⅲ型電轉移槽（北京六一儀器廠）。

2 方法

2.1 MTT法檢測莪術油對HEC-1-B細胞增殖抑制作用將生長達到80% ～90%的HEC-1-B細胞棄掉培養(yǎng)液，PBS沖洗后加入0.25%胰酶細胞消化液，當細胞密度達到1×104·mL-1時將此注入96孔板內，每孔200μL，放入體積分數5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，換液，各組加入含莪術油（120 mg·L-1、240 mg·L-1、480 mg·L-1、960 mg·L-1）的培養(yǎng)基150μL，對照組加入無血清的培養(yǎng)基，作用細胞48 h，于培養(yǎng)結束前4 h，每孔加入MTT試劑20μL（5 g·L-1），作用4 h，去除上清液，加入150μL，每孔DMSO，于搖床上低速振蕩10 min后，用酶標儀在490 nm波長測定吸光度（A）值。應用MTT法測細胞增殖抑制的情況。每組設8個平行復孔，計算細胞抑制率。

2.2 Hoechst33258熒光染色檢測HEC-1-B細胞凋亡將對數生長期的HEC-1-B細胞制成濃度為1×105·mL-1單細胞懸液，接種于24孔板培養(yǎng)24 h后，進行分組，莪術油組加入含有不同濃度莪術油（120 mg·L-1、240 mg·L-1、480 mg·L-1、960 mg·L-1）的DMEM培養(yǎng)基，正常對照組加入無血清培養(yǎng)基，作用細胞48 h，進行Hoechst 33258熒光染色，鏡下觀察莪術油對細胞凋亡的情況并拍照。

2.3 W estern blot法檢測相關蛋白表達對照組細胞加入無血清培養(yǎng)基，實驗組加入莪術油（120 mg·L-1、240 mg·L-1、480 mg· L-1、960 mg·L-1）處理細胞作用48 h后，收集細胞，放入冷的細胞裂解液中作用30 min，細胞樣品反復吹打，4℃，12 000 g，離心半徑8 cm，離心20 min后，把上清液移至新管，用BCA試劑盒測定蛋白含量，將各組蛋白含量調成一致。將玻璃板清洗干凈后，蒸餾水沖洗，固定好板子后，配制10%SDS-PAGE凝膠溶液（根據分子量選擇相應濃度的分離膠），每孔上樣20μL，加適量電泳緩沖液，進行電泳來分離蛋白質，并適時終止電泳。將膠浸泡于轉膜液中，標記膠的方向，然后于搖床上30 min低速震蕩。截取和膠的大小一致PVDF膜，甲醇溶液浸泡，浸透后將PVDF膜轉移浸入轉膜液中5 min以上。取一張用轉膜液浸潤的濾紙放在半干轉印儀的電極板底層上，放上PVDF膜，再將膠貼于PVDF膜上；再取用轉膜液潤濕另一張厚濾紙，鋪在分離膠的上面，用玻璃試管壓緊趕走氣泡；蓋上頂層電極板，接通電源，進行半干轉印；轉膜結束后，將PVDF膜浸泡在封閉液中，與膠相鄰面要向上，放置在水平搖床上緩慢震蕩1 h以上。取出PVDF膜，裁取想要的位置并放置于含有一抗抗體的雜交液盒中孵育；取出PVDF膜，應用TBST清洗PVDF膜3次，每次5 min；然后把PVDF膜放入裝有二抗的雜交液盒中，搖床上震蕩雜交1 h；取出PVDF膜，用TBST清洗3次，每次5 min；將ECL超敏化學發(fā)光試劑盒內的試劑A與試劑B等體積混合后，均勻滴在PVDF膜上，反應后利用凝膠成像采集系統進行曝光，并對蛋白條帶進行分析。

2.4 統計學方法采用SPSS 17.0軟件對實驗結果進行分析，實驗計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間樣本的比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 不同濃度的莪術油對HEC-1-B細胞增殖的影響與對照組比較，不同濃度的莪術油（120mg·L-1、240mg·L-1、480mg·L-1、960mg·L-1）作用HEC-1-B細胞48 h后，吸光度值明顯降低，差異有統計學意義（t＝8.336，P＜0.01；t＝12.609，

P＜0.01；t＝13.583，P＜0.01；t＝17.766，P＜0.01），說明莪術油能夠明顯抑制HEC-1-B細胞的增殖，呈一定的濃度依賴性。根據各組吸光度值計算細胞抑制率，結果顯示，隨著莪術油濃度的增大，其對HEC-1-B細胞的抑制率也逐漸增加。見表1。

表1 不同濃度的莪術油對HEC-1-B細胞增殖的影響（±s）

表1 不同濃度的莪術油對HEC-1-B細胞增殖的影響（±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01

/%對照組組別 n 吸光度值 細胞抑制率8 1.14±0.12 0莪術油120 mg·L-1組 8 0.71±0.08** 37.10±7.10莪術油240 mg·L-1組 8 0.52±0.07** 53.90±6.20莪術油480 mg·L-1組 8 0.40±0.10** 65.20±8.70莪術油960 mg·L-1組 8 0.25±0.08**77.90±6.80

3.2 不同濃度的莪術油對HEC-1-B細胞凋亡的影響熒光顯微鏡觀察發(fā)現，與對照組比較，莪術油各組細胞都出現細胞核固縮、碎裂、熒光亮度變強等凋亡特征，細胞凋亡率顯著增加。

3.3 不同濃度的莪術油對HEC-1-B細胞凋亡相關蛋白表達的影響與對照組比較，莪術油作用細胞48 h后，隨著莪術油濃度的升高，細胞內Caspase-3蛋白表達均明顯增加，差異有統計學意義（t＝6.079，P＜0.01；t＝19.545，P＜0.01；t＝34.903，P＜0.01；t＝21.151，P＜0.01）；Bax蛋白表達均明顯增加，差異有統計學意義（t＝7.146，P＜0.01；t＝13.809，P＜0.01；t＝15.890，P＜0.01；t＝52.971，P＜0.01）；Bcl-2蛋白表達顯著降低，差異有統計學意義（t＝0.797，P＞0.05；t＝3.044，P＜0.05；t＝6.309，P＜0.01；t＝11.455，P＜0.01）。見表2、圖1。

表2 不同濃度的莪術油對HEC-1-B細胞凋亡相關蛋白表達的影響（±s）

表2 不同濃度的莪術油對HEC-1-B細胞凋亡相關蛋白表達的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

Caspase3/GAPDH Bcl-2/GAPDH Bax/GAPDH對照組組別 n 3 0.359±0.015 0.599±0.072 0.252±0.019莪術油120mg·L-1組 3 0.440±0.017**0.548±0.084 0.593±0.055**莪術油240mg·L-1組 3 0.629±0.018**0.442±0.052* 0.735±0.044**莪術油480mg·L-1組 3 1.016±0.029**0.324±0.023** 1.031±0.071**莪術油960mg·L-1組 3 1.254±0.072**0.121±0.006** 1.142±0.017**

圖1 不同濃度的莪術油對HEC-1-B細胞凋亡相關蛋白表達的影響

4 討論

自殷墟出土的甲骨文中，就有“瘤”的記載。漢代劉熙《釋名》定義為“瘤，流也，血流聚生而瘤腫也。”周代有瘍醫(yī)之位，其主治范圍包括“腫瘍”，即腫瘤類疾病。子宮內膜癌相當于中醫(yī)學的“癥瘕”，唐代孫思邈《千金要方》中載有明確的病機，明確其病位在下焦，為腹中積塊，或脹或痛的疾病，并有固定的方藥。《黃帝內經》認為“正氣存內，邪不可干。”子宮內膜癌的基本病機是正氣虧虛，熱毒內聚，氣滯血瘀。治療原則是解毒化瘀，扶正消積。莪術具有破血逐瘀作用，可縮小瘤體，改善全身狀況，提高生存質量［5-9］，莪術油可抑制HEC-1-B細胞增殖，并促進其細胞凋亡［10］。

細胞凋亡是刪除細胞的一種選擇性過程，是組織大小調節(jié)和形態(tài)發(fā)生所必需的生理過程。在哺乳動物細胞中，凋亡是由兩種不同的信號途徑誘導的：外部或死亡受體和內在或線粒體［6］。Bcl-2家族的蛋白質已被確定為線粒體途徑的基本成分。Bcl-2家族的成員可以通過合成抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xl）或促凋亡蛋白（Bax、Bak、Bad、Bd、Bcl-xs）來促進或抑制細胞凋亡。在人類的各種癌癥組織中，包括乳腺癌、結腸癌、胃癌、甲狀腺癌和子宮內膜癌，都觀察到了抗凋亡Bcl-2基因的表達［7］。Bcl-2家族基因與子宮內膜癌之間的關系主要通過對人體組織樣本的體外研究得到揭示［8］；過多的Bcl-2表達會減緩細胞生長，高表達會導致細胞死亡，而較低的表達則可能是抑制人類乳腺和子宮內膜癌組織凋亡的跡象。研究還表明，Bcl-2的表達因腫瘤的侵入性和分化程度而有所不同，而Bcl-2表達在較高級的癌癥中與較低級的癌癥相比是非常低或不存在的。據推測，在癌癥發(fā)生發(fā)展期間，Bcl-2的表達可能會被抑制。因此，Bcl-2的表達高低被用來作為預測癌癥進展和預后的重要指標。本實驗結果表明，與對照組相比較，莪術油組Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，Bax蛋白表達水平顯著增加，且Bcl-2/Bax明顯降低。說明莪術油可能是通過降低Bcl-2蛋白表達、增加Bax蛋白表達，進而抑制腫瘤細胞的生長，誘導腫瘤細胞凋亡。

在細胞凋亡過程中，Caspase-3是最主要的終末剪切酶［9-10］，也是CTL細胞殺傷重要的組成部分。Caspase-3在細胞凋亡中起著不可替代的作用，可以被多種因素活化，被激活后，可以使蛋白酶多聚（ADP-核糖）及與細胞結構、細胞周期及DNA核酸復制等相關聚合酶PARP失活，從而導致細胞凋亡［11-12］。并且Caspase-3被激活后還可以進一步使Bcl-2滅活，讓細胞的形態(tài)和功能發(fā)生改變，誘導細胞凋亡。已有研究表明，莪術油能導致肺腺癌A549細胞凋亡，其可能與Bcl-2和Bax蛋白表達有關。與對照組比較，莪術油作用HEC-1-B細胞48 h后，細胞內的Caspase-3和Bax蛋白表達顯著增加，Bcl-2蛋白表達顯著降低，Bcl-2/Bax的比值降低。表明莪術油能夠誘導HEC-1-B細胞凋亡，其作用機制可能是通過增加了Caspase-3、Bax的表達水平和降低Bcl-2表達水平有關。

大量研究證實，莪術油具有抗腫瘤、抗病毒和提高人體免疫等作用，通過許多藥理作用及臨床應用研究，證明了莪術油藥理活性較好、抗腫瘤效果好、藥物安全性高。但莪術油成分較多且組成復雜，因此其抗腫瘤機制也比較復雜，我們的實驗僅對莪術油凋亡因子方面做相關研究，為進一步研究莪術油抑制子宮內膜癌提供實驗依據，但其作用機制需進一步研究。