ARTP誘變選育γ-聚谷氨酸高產菌株快速篩選方法的建立

劉丹丹，臧毅鵬，王 利，王夢夢，岳文瑾，余晨銳，陳俊柳，聶光軍

(安徽工程大學 生物與食品學院，安徽 蕪湖 241000)

γ-聚谷氨酸(γ-Polyglutamic acid,γ-PGA)是一種由谷氨酸單體聚合而成的高分子多聚物，具有無毒和可降解性，被廣泛應用于食品行業。如作為益生菌的低溫保護劑，提高益生菌在生產過程中的存活率；在面粉加工過程中，γ-PGA可以減緩淀粉老化，提高面制品的彈性和韌性等。目前，γ-PGA主要通過微生物發酵生產，但目前菌株生產效率滿足不了市場對γ-PGA的需求，導致γ-PGA的價格居高不下。為提升菌株生產效率，各種誘變方法被使用，其中物理射線誘變相對于化學誘變具有簡單、環境污染小等特點。常用的物理誘變主要通過紫外線、X射線等射線輻照微生物，以改變DNA，但這些方法存在誘變效率低以及可控性差等問題。近幾年興起的常壓室溫等離子體(Atmospheric and Room Temperature Plasma,ARTP)誘變技術因具有突變率高，對人體和環境無毒害，易操作等優點，常被用于微生物菌種誘變。

然而，基于ARTP誘變選育γ-PGA高產菌株的過程中，阻礙誘變選育效率的可能是其篩選方法的低效。面對大量誘變菌株，使用傳統方法逐一測定每個菌株的產量則需要耗費過多的精力與時間。γ-PGA產生菌在生長過程中，由于各種蛋白酶的作用，往往在其周圍的培養基上形成一個透明圈，透明圈的大小則反映了蛋白酶的活性，而γ-PGA在生產過程中又與蛋白酶存在著偶聯關系。為此，在篩選一株γ-PGA高產菌株并在對其進行鑒定的基礎上，分析酪蛋白平板初篩、多孔板復篩(24孔板與48孔板)和搖瓶復篩之間的關系，嘗試建立透明圈與菌落面積的比例(圈徑比)與γ-PGA產量之間的關系，簡化篩選流程，通過圈徑比大小直觀快速篩選γ-PGA高產突變株，快速提升ARTP誘變選育γ-PGA高產菌的效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生產γ-PGA的出發菌株(市售納豆粉中篩選獲得,命名為MA1);L-谷氨酸(國藥化學試劑有限公司);γ-聚谷氨酸(四川拙誠日化科技有限公司,純度大于95%);細菌基因組提取試劑盒、Taq酶、引物和相關PCR試劑(上海生工生物工程有限公司)。

1.2 菌株鑒定

通過對菌株的形態學研究、菌落形態觀察、菌株的生理生化實驗3個方面對菌株進行鑒定。將MA1接種到固體培養基(牛肉膏5 g/L、胰蛋白胨5 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂15 g/L、pH 7.0)，37 ℃培養24 h，觀察菌落形態。將MA1接種到種子培養基(牛肉膏3 g/L、葡萄糖5 g/L、胰蛋白胨5 g/L、NaCl 5 g/L、pH 7.0)，37 ℃培養24 h，革蘭染色鏡檢觀察菌株形態。將MA1接種到酪蛋白培養基(脫脂奶粉50 g/L、瓊脂15 g/L、pH 7.0)，37 ℃培養24 h，觀察菌落形態。將MA1接種到液體發酵培養基(蔗糖28.87 g/L、胰蛋白胨17.56 g/L、L-谷氨酸15.26 g/L、pH 7.0)，37 ℃培養24 h后，將發酵液滴入纖維蛋白平板(2%瓊脂糖、20 IU凝血酶溶液、0.3 mg纖維，總體積為10 mL)中，觀察發酵液的纖維降解能力。

基于SDS-堿裂解法原理，應用細菌基因組提取試劑盒提取MA1基因組，應用引物(27F/1492R)擴增16S rDNA，并對其進行測序(合肥通用生物)，測序結果通過blast比對，應用MEGA 7.0制作進化樹，從分子水平鑒定MA1。應用引物NK-F(GGGGTACCGTATGAAAATAGTTATTTCGAGTCTCTACG)和NK-R(AACTGCAGTCCGGTGCTTGTGAAGATTTC)PCR擴增aprN(納豆激酶編碼基因)，并測序比對，鑒定MA1與納豆菌(Bacillus Subtilis Natto)的關系。

1.3 菌株篩選方法的研究

(1)初篩方法：選用混濁、易被菌種分解利用的酪蛋白平板接種MA1，每4 h測量菌體直徑及水解圈直徑，計算圈徑比(水解圈與菌體直徑之比)，分析圈徑比與MA1的γ-PGA產量之間的變化關系。

(2)復篩方法：分別采用24孔板、48孔板接種對數期的種子液，孔板接種量和裝液量比例同100 mL搖瓶發酵(7.5%接種量/30 mL發酵培養基)，37 ℃、200 rpm發酵培養，每4 h取樣檢測γ-PGA產量，以研究孔板體積對γ-PGA產量的影響，確定多孔板類型。在此基礎上，進一步應用24孔板發酵(37 ℃、200 rpm)，每4 h取樣檢測γ-PGA產量，考察其與相同條件下搖瓶發酵之間的相關性，確定最佳復篩方法。

1.4 ARTP誘變選育

(1)誘變菌懸液的制備：種子液37 ℃、200 rpm培養至對數期，取l mL菌液4 500 rpm離心去上清液，加入等量生理鹽水重懸菌體，OD在0.8～1.0之間待用。

(2)生長及發酵曲線的測定：將對數期的種子液以7.5%的接種量接入裝液量為30 mL的發酵培養基中(100 mL錐形瓶)，37 ℃、200 rpm震蕩培養，每4 h取樣測菌濃和γ-PGA產量。

(3)ARTP誘變：將8個裝有990 μL生理鹽水的EP管依次置于ARTP誘變儀(無錫源清天木生物科技公司)相應凹槽的底部，紫外滅菌20 min，將8個鋪滿10 μL菌液的ARTP載片依次置于ARTP誘變儀相應凹槽中，誘變時間依次為0 s、15 s、30 s、45 s、60 s、90 s、120 s和160 s(誘變條件：99.99%的高純氦氣，電源功率120 W、氣體流量10 SLM、照射距離2 mm、溫度<30 ℃)。誘變結束后，震蕩洗脫EP管2 min，使載片上的菌體完全混于生理鹽水中，再將EP管置于4 ℃冰箱中，保存2 h，避免自省對突變損傷進行修復。最后將誘變液稀釋一定倍數(原液菌濃度約為1.08×10cfu/mL)，取100 μL分別涂布于固體培養基和酪蛋白平板，每組3個平行，37 ℃培養，記錄固體培養基平板上的菌落數量，根據下式計算致死率，并繪制致死率曲線。測量酪蛋白板上的圈徑，并計算圈徑比。

式中，

N

為誘變固體平板上的菌落數；

M

為誘變處理后平板上的菌落數。

(4)遺傳穩定性研究：將篩選的突變株傳代培養5次，檢測γ-PGA的產量以考察其遺傳穩定性。

1.5 γ-PGA產量測定

參照Zeng等報道的方法。10 000 rpm離心發酵液10 min，取上清液；加入4倍體積冰乙醇，置于4 ℃冰箱中過夜，10 000 rpm離心10 min取沉淀；將沉淀55 ℃下烘干至恒重，加入與發酵液等體積的蒸餾水復溶；溶解完全后，10 000 rpm離心10 min去除不溶物，將上清適當稀釋后測定OD216(TU-1810PC紫外可見光分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司)，根據γ-PGA標準曲線計算γ-PGA產量。

2 結果與分析

2.1 菌株的鑒定

對菌株MA1進行形態學鑒定如圖1所示。圖1a顯示菌株MA1是一種類圓形，邊緣呈鋸齒狀，表面褶皺不透明，在菌體中央有粘液并且可產孢子的菌種；對菌株MA1的菌落形態進行革蘭氏染色顯微觀察。圖1b為桿狀紫色，證明菌株MA1為革蘭氏陽性細菌；對菌株MA1進行生理生化實驗的鑒定。圖1c顯示在酪蛋白板上出現水解圈，說明該菌株含有蛋白酶，對酪蛋白有降解能力。圖1d顯示在纖維蛋白平板上有明顯的水解圈形成，說明該菌株產生了纖溶蛋白酶可降解纖維蛋白原以及纖維蛋白。觀察結果與枯草芽孢桿菌168(模式菌)生理生化特性基本相同，因而，初步推斷菌株MA1屬于可生產蛋白酶的芽孢桿菌。

圖1 菌株鑒定

對菌株MA1進行分子生物學鑒定如圖2所示。由圖2可見，在約1 500 bp處有一條明顯的條帶，與預期16S rDNA的大小相符。經測序后得到菌株MA1的16S rDNA序列，通過與GenBank已報道的序列比對，利用MAGE 7.0軟件繪制菌株MA1系統發育樹(見圖3)，菌株MA1與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的同源性高達99%，由此確定菌株MA1為枯草芽孢桿菌。進一步PCR擴增該菌株的aprN基因，圖2b顯示該擴增片段與已報道aprN基因序列(1473 bp)基本一致。測序結果顯示，所得NK基因與Nakamura報道的aprN基因序列(GI:262756)相同。因為aprN基因序列具有高度的特異性，主要產生菌為納豆枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis Natto，簡稱納豆菌)。因此，可以確定菌株MA1屬于納豆菌。

圖2 MA1 16S rDNA和aprN基因PCR產物電泳圖譜

圖3 菌株MA1 16S rDNA的系統發育樹

2.2 篩選方法確定

對數生長期的納豆菌代謝旺盛，菌體比生長速率最大，細胞的數量呈指數上升，且抗不利環境的能力最強。因此，微生物發酵和誘變選擇對數生長期的菌株。發酵液與種子液中的培養基成分、接種量及菌齡都不相同，菌株在發酵液中的生長曲線就會受到一定的影響。通過測定菌體生長與γ-PGA產量，可以更直接地觀察兩者間的關系，對菌株篩選與分析發酵液中γ-PGA生產過程有重要的意義。

種子液菌株MA1的生長及發酵曲線如圖4所示。由圖4可知，菌株前4 h增殖緩慢，處于延滯期；4～12 h菌體急劇增殖，比生長速率最大，處于對數期；14～36 h菌體數量處于動態平衡，此時為穩定期；36 h后菌體數量開始下降，進入衰亡期。為了滿足足夠的接種量、旺盛的菌種生長活力及實驗的統一性，后期誘變和發酵選擇10～12 h的菌種液。相對于菌體生長，γ-PGA生產進程明顯滯后。細胞生長處于延滯期時無γ-PGA產生，細胞對數期γ-PGA產量增加緩慢，穩定期γ-PGA生產明顯加速。說明γ-PGA生產與菌體增殖存在一定關聯，這種次級代謝產物與初級產物聯系更為緊密。之前的研究結果顯示，隨菌體的生長納豆激酶的含量增加，菌體細胞處于對數期，納豆激酶含量達到最大，菌體生長進程與納豆激酶等蛋白酶的生產偶聯，γ-PGA生產由蛋白酶水解底物產生的代謝物質，由此推斷γ-PGA生產與蛋白酶的生產也可能存在一定關聯。孔板對菌株γ-PGA產量的影響、24孔板與搖瓶發酵的相關性以及搖瓶發酵γ-PGA產量與菌株酪蛋白平板上的菌圏比之間的變化趨勢如圖5所示。由圖5a顯示，24和48孔板中γ-PGA產量變化趨勢基本相同。其中，24孔板中的γ-PGA產量明顯較高，這是由于納豆菌是好氧菌，48孔板內菌液的表面接觸氧氣較24孔板小，從而影響菌株生長代謝過程中的溶氧量，因此，24孔板更有利于菌株 MA1的生長代謝，相對于孔板溶氧，搖瓶溶氧效果更好。由圖5b顯示，24孔板和同期搖瓶的γ-PGA產量相近(R=0.978 8)，說明24孔板具有較好的溶氧量，滿足γ-PGA生產對溶氧的需求。因此，為提升誘變復篩效率，可用24孔板培養替代搖瓶培養。

圖4 種子液菌株MA1的生長及發酵曲線

面對誘變出現的大量菌株，使用快速有效的篩選方法是提高誘變選育效率的關鍵。納豆菌發酵過程中會產生蛋白酶，在其水解酪蛋白后會在菌落周圍形成一個酪蛋白水解圈，水解圈與菌落大小的比值可以間接表示蛋白酶活力的大小，這一方法被廣泛用于產酶菌種的初篩。為了驗證前文關于蛋白酶與γ-PGA生長之間存在關聯的推斷，菌液涂布于酪蛋白平板后，觀察圈徑比與γ-PGA產量之間的變化關系，由圖5c顯示，圈徑比隨著菌體的生長在16～24 h迅速增加，與酪蛋白的生長高度偶聯，因為次級代謝產物的生產一般滯后于初級代謝產物，因此γ-PGA生產曲線相對于酪蛋白生產同步后移，且生長趨勢基本相同，間接證明了菌株MA1蛋白酶的生產與γ-PGA產量可能存在關聯。

圖5 孔板對菌株γ-PGA產量的影響、24孔板與搖瓶發酵的相關性以及搖瓶發酵γ-PGA產量與菌株酪蛋白平板上的菌圏比之間的變化趨勢

2.3 ARTP誘變選育

致死率是獲得優良突變株的關鍵參數。ARTP輻照MA1的致死曲線如圖6a所示。由圖6a可知，誘變致死率隨誘變時間的增加在不斷升高，誘變時間為90 s時，致死率達到88.16%。誘變300 s時，致死率為100%。由于突變具有隨機性，正負突變與誘變時間無明確的規律可循，但因為誘變時間越長，會使DNA鏈和氫鍵斷裂的程度、胸腺嘧啶二聚體形成的程度及宿主修復后造成的差錯程度加大，從而造成菌株損傷加重，與出發菌株相比變化更大。因此，為提高突變株篩選效率，誘變時間選為270 s。經過5輪誘變(出發菌株為實驗室前期篩選菌株MA1)，在23株菌株中篩選獲得8株相對高產的突變株(見圖6b)。其中，3株為正突變株，m3的γ-PGA產量最高，達到9.22 g/L，較出發菌株提高了22.03%。誘變菌的產量提高率相較于張浩誘變菌產量提高的42.11%偏低，但其出發菌株的γ-PGA產量僅為本實驗出發菌株產量的十分之一。對突變株m3進行連續5次發酵后，其產量在9.2 g/L左右(見圖6c)，說明突變體遺傳穩定性較好。分析23株突變體的圈徑比與其γ-PGA產量之間的關系，如圖6d所示，樣本量為24個(包括出發菌株)，圈徑比和γ-PGA產量之間

R

值為0.64。一般而言，當樣本量超過9個，

R

值達到0.7，或當樣本量超過25個，

R

值達到0.4，都可認為兩變量間存在相關性。據此，我們認為菌株圈徑比和γ-PGA產量存在相關性，為基于酪蛋白透明圈篩選γ-PGA高產菌株提供了依據。

圖6 ARTP輻照MA1的致死曲線、誘變菌株的γ-PGA產量、突變菌株的遺傳穩定性以及菌株γ-PGA產量與其在酪蛋白平板上的圈徑比之間的關系

3 結論

研究在篩選到一株高產γ-PGA納豆菌的基礎上，系統分析酪蛋白板初篩、多孔板復篩和搖瓶復篩，發現多孔板復篩與搖瓶復篩結果一致。其中，多孔板復篩與酪蛋白平板形成的納豆菌的圈徑比具有線性關聯，這為直接應用酪蛋白平板初篩代替原用的平板初篩加多孔板復篩提供了依據。基于酪蛋白平板的透明圈快篩方法，從ARTP輻照的菌群中篩選出一株γ-PGA高產株，產量較出發菌株提升了22%，且遺傳穩定性良好，表明酪蛋白平板的透明圈快篩方法有效，這大幅壓縮了篩選的時間，顯著提升了菌株誘變選育的效率。