TCDD和汞、鎘、鉛、砷聯合毒性效應及機理研究進展

張元元，郭少娟，王菲菲，楊立新

環境基準與風險評估國家重點實驗室，中國環境科學研究院

隨著科學技術的進步和人類社會的發展，人類生產活動向環境中釋放了大量有毒、有害化學污染物，如重金屬、殺蟲劑和持久性有機污染物等，使得人類和動物不可避免地暴露其中，進而引發肥胖、糖尿病、代謝紊亂、心血管疾病和癌癥等多種疾病以及死亡、發育異常和生物多樣性下降[1]。有機化學物質和重金屬是環境中普遍存在的兩大類污染物，有機化學物質污染物一般具有高毒性、持久性和生物累積性，而重金屬汞、鎘、鉛等在環境中難以降解。有機化學污染物和汞、鎘、鉛、砷一般通過影響細胞中關鍵蛋白質功能、信號通路和代謝途徑，進而影響生命個體的新陳代謝，造成毒性效應和健康損害。在分析、總結芳香族致癌化學物質2,3,7,8-四氯代二苯并二英(TCDD)和汞、鎘、鉛、砷單一、復合毒性效應及機理的基礎上，歸納不同污染物復合毒性效應與其誘導基因表達水平之間的關系，并討論基于基因表達水平來評價復合毒性效應的可行性。

1 污染物來源與暴露途徑

1.1 TCDD

TCDD是一類毒性極強的芳香族化合物，作為工業過程的副產品，主要來源于農藥制造、垃圾焚燒、紙張氯漂白等過程，其中廢物燃燒是二英的最大來源[2]。我國珠江三角洲水域二英濃度與分布的測定結果顯示，部分水體TCDD濃度最高達到了50.189 0 ngL，呈重度污染[3]。排放到環境中的TCDD通過食物鏈在人體和野生動物體內累積，人體內TCDD的半衰期為7.1～11.3 a[4-5]。人類暴露于TCDD的主要途徑是食用受污染的食物，尤其是奶制品、肉類和魚類。Perelló等[6]研究了一些食物中的TCDD濃度發現，蔬菜、水果、豆類和谷物中約為1 pgkg，魚類和海鮮為21 pgkg，肉類和乳制品分別為4和6 pgkg。根據美國國家環境保護局(US EPA)2012年提出的TCDD每日最大允許攝入量為0.7 pgkg，部分人群正面臨著低劑量和慢性TCDD暴露。

1.2 汞

汞在自然界以3種化學形態存在：金屬汞或汞蒸氣(Hg0)、無機汞化合物(Hg2+)和有機汞化合物。甲基汞是環境中最常見的有機汞化合物，主要由微生物將無機汞甲基化而形成。環境中的汞主要來源于人類活動和自然排放。化石燃料生產與燃燒、有色金屬冶煉等是大氣汞的主要來源[7-9]。據估計，在全球范圍內，通過自然、人為來源和過去活動再排放產生的汞為6 000～11 000 ta，其中約80%來自人類活動[10]。中國大氣中汞的觀測值超過了北半球的背景值，顯著高于北美和歐洲的觀測值[11-12]。食物是無脊椎動物、魚類和陸生野生動物甲基汞暴露的主要途徑[13-15]。美國500個湖泊采集的魚類樣本中，汞濃度大于2 μgkg，食魚動物體內的汞濃度為23～6 605 μgkg[16]。同樣，分布在非洲12個國家的166種不同魚類的總汞濃度為5.5～1 865.0 μgkg[17]。魚類和海產品的消費被認為是大多數非職業人類汞暴露的主要途徑。

1.3 鎘

鎘是我國最嚴重的土壤重金屬污染物之一，屬于致癌物質。環境中的鎘主要來源于自然和人類活動的排放。Zhou等[18]對我國寧波市重金屬污染現狀進行了調查，在所有檢出重金屬的蔬菜樣品中，工業、郊區和農村種植的蔬菜鎘超標率分別為43.9%、27.5%和5.0%，表明寧波市鎘污染較為嚴重。Zhao等[19]對我國南方17個地點采集的30個大豆籽粒樣品和17個大豆田土壤樣品中的金屬進行分析發現，12個土壤樣品的鎘濃度高于土壤最大允許值，大豆籽粒樣品中鎘濃度為0.11～0.91 mgkg。食用鎘污染的食物是鎘暴露的主要途徑，在世界范圍內膳食鎘攝入量從較清潔地區的10～40 μgd到重污染地區的幾百μgd[20]。煙草中含有鎘，主動吸煙和被動吸煙被認為是鎘暴露的另一重要途徑。

1.4 鉛

鉛在植物和土壤中自然存在，鉛污染來源包括鉛的冶煉、蓄電池的生產和處理以及含鉛燃料的燃燒等[21]。我國作為鉛生產大國和消費大國，鉛污染形勢較嚴峻，僅2014年我國鉛產量達到422.13萬t，其中蓄電池行業是污染的主要來源[22]。吸入鉛污染的灰塵顆粒或氣溶膠，食用和飲用鉛污染的食物、水等是鉛暴露的途徑[23]，其中食物是鉛暴露的主要途徑。嬰兒和兒童比成年人更容易受到鉛毒性的影響。從我國江蘇省23個食品類別中采集的2 077份食品樣本分析顯示，城市和農村人口的膳食鉛平均攝入量分別為1.494和1.822 μg(kg·d)；而2～6歲兒童的膳食鉛攝入平均水平為3.019 μg(kg·d)，在不同年齡階段的群體中濃度最高[24]。

1.5 砷

砷屬于致癌物質，在環境中主要以硫化物礦形式存在，被廣泛應用于某些殺蟲劑和藥物。環境中砷污染主要源于巖石風化和火山噴發等自然活動。采礦、冶煉、化石燃料燃燒和半導體生產等過程也釋放砷。全球每年由于人類活動排入水體中的砷約為120萬t，而自然作用釋放到水環境中的砷約為2.2萬t。我國183個湖泊、531個水庫的調查結果顯示，水環境中的砷濃度逐年增高[25]。此外，我國土壤中砷濃度的平均值為世界平均值的2倍，我國有58萬km2的土壤砷濃度超過10 μgL，近2 000萬人生活在土壤砷污染高風險區[26]。砷暴露主要通過攝入、吸入、皮膚接觸等途徑。

2 單一毒性效應與作用機理

2.1 TCDD

TCDD的毒性效應與其誘導芳香烴受體(AhR)能力密切相關。AhR是一種核轉錄因子，除了調節細胞生長、分化和遷移等過程[35-37]，還具有化學和微生物防御、干細胞祖細胞的穩態維持以及皮膚和胃腸道等屏障器官的免疫調節等生理功能[38]。TCDD與AhR結合后，激活AhR使之與HSP90XAP2P23伴侶蛋白復合物解離，與配體結合轉位到細胞核，與芳香烴受體核轉位蛋白(ARNT)形成活性異源二聚體，配體AhRARNT復合物作為轉錄因子與響應元件(XRE)結合，進而引起一系列基因轉錄調節的變化[39-41]，產生毒性效應。TCDD介導的具體信號通路見圖1。AhR激活可上調多種代謝酶表達，包括Ⅰ期酶細胞色素P4501A1 (CYP1A1)、P4501A2 (CYP1A2)、P4501B1 (CYP1B1)以及Ⅱ期代謝酶如GST-A1和UGT1-06等[42-43]，其中CYP1A1是AhR激活后最有效的誘導基因[35]。Ⅱ期酶參與有毒化合物的解毒過程;Ⅰ期酶可將多種環境中的有機物轉化為細胞毒素或其他致癌物質，從而增加癌癥發生的風險。此外TCDD也可以通過誘導氧化應激，造成DNA損傷，引發毒性[44]。TCDD有害結局途徑(adverse outcome pathway，AOP)見圖2。

圖1 TCDD介導的芳香烴受體信號通路Fig.1 TCDD-mediated aromatic hydrocarbon receptor signaling pathway

圖2 TCDD有害結局途徑(AOP)Fig.2 Adverse outcome pathway (AOP) of TCDD

2.2 汞、鎘、鉛、砷

汞、鎘、鉛、砷在人體內累積會對各器官造成嚴重的傷害，尤其是呼吸系統、神經系統、生殖系統和消化系統。汞慢性暴露引起中樞神經系統癥狀，如震顫、妄想和神經認知障礙[45]。毒性最強的甲基汞可以引起言語、行動和視覺障礙以及周圍神經病變和共濟失調[46]。鎘易在人體骨骼、肺、肝、腎和神經組織中積聚，擾亂或損傷組織功能[47]，其中骨骼毒性是鎘暴露引發的典型特征。Cd2+在低劑量下也會引起大鼠腎功能衰竭和自噬[48]。鉛中毒對神經系統影響最大，嬰幼兒對低水平的鉛尤其敏感，可導致行為紊亂和智商下降。低劑量鉛暴露導致斑馬魚胚胎毒性、行為改變和斑馬魚成年學習記憶缺陷[49]。暴露于2 000 mgkg的鉛濃度下，蚯蚓死亡率升高，體重顯著下降，繁殖受到抑制[50]。砷暴露可造成皮膚損傷、循環障礙、神經系統并發癥、肝和腎功能障礙等[51]。幼年小鼠暴露于砷會減少對流感病毒的清除并加劇炎癥反應，導致肺和氣道結構發生急性和長期變化[52]。成年小鼠暴露于10 mgL的砷4周后，腸道微生物組成與代謝明顯紊亂[53]。

汞、鎘、鉛、砷可通過幾個關鍵機制引起毒性，包括破壞重要的酶功能，誘導產生活性氧(ROS)，破壞離子調節平衡，形成DNA和蛋白質加合物等[54]。汞、鎘、鉛、砷的AOP見圖3，其在體內積累時誘導生成活性氮(RNS)和ROS，導致質膜脂質過氧化。生成的RNS和ROS可能干擾電子傳遞系統[55]。此外，細胞質中過量的金屬離子會破壞細胞內的氧化還原平衡，引起細胞質pH和蛋白構象的改變，阻礙蛋白功能，最終導致細胞功能障礙、凋亡或壞死。汞、鎘、鉛、砷能與硫醇、咪唑等官能團中的硫、氮和氧原子以及蛋白質的羧基相互作用[19,56-57]。汞、鎘、鉛、砷可以通過抑制超氧歧化酶的酶活性，減少抗氧化功能蛋白質表達，結合細胞內氧化還原平衡蛋白質的—SH基團來誘導氧化應激[58-60]。TCDD、汞、鎘、鉛、砷單一暴露毒性效應見表1。

圖3 汞、鎘、鉛、砷有害結局途徑(AOP)Fig.3 Adverse outcome pathway(AOP) of mercury,cadmium,lead and arsenic

表1 TCDD、汞、鎘、鉛、砷單一暴露毒性效應

3 聯合暴露毒性效應及作用機理

3.1 TCDD與汞聯合暴露

重金屬和TCDD在環境中聯合暴露可以通過改變CYP1A1基因的表達來增強或降低多環芳烴的致癌性[77-79]。金屬離子可以改變小鼠肝癌Hepa 1c1c7細胞和人類肝癌HepG2細胞中幾種AhR調控基因的表達。Hg2+在HepG2細胞中抑制TCDD介導的CYP1A1的表達[80]，而在Hepa 1c1c7細胞中顯著增強了TCDD介導的CYP1A1蛋白的誘導作用[78]。C57BL/6小鼠肝外組織的聯合暴露試驗也證明了Hg2+以時間、組織和分子水平依賴的方式調節TCDD誘導的AhR調控基因[81]。目前TCDD與汞聯合暴露的研究主要集中于對特定基因(如CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、NQO1、GSTA1和HO-1)的影響[81-83]。然而聯合暴露的結果可能比對特定基因和通路的影響更廣泛，聯合暴露導致一些基因的表達呈加性或拮抗效應，還會誘導一些不同于單一暴露的基因表達與疾病產生[84]。Jagannathan等[84]對汞和TCDD聯合暴露的人類支氣管上皮細胞(BEAS-2B)進行轉錄組分析，發現與單一不可見效應濃度(no-observed effect concentration，NOEC)暴露相比，聯合暴露的細胞中與慢性阻塞性肺疾病(COPD)以及心血管疾病相關的幾個過程(如IL9信號、動脈粥樣硬化信號和脂肪生成信號)的通路顯著富集，表明聯合暴露導致發生氣道組織重構、COPD以及心血管疾病的風險更高。

3.2 TCDD與鎘聯合暴露

鎘和TCDD聯合暴露可通過抑制CYP1A1的誘導水平和活性降低TCDD的代謝率，從而降低TCDD的致癌性。在斑馬魚肝細胞系中，Cd2+抑制TCDD介導的CYP1A1蛋白、酶活性和mRNA表達水平，Cd2+還下調AhR2和ARNT2b的mRNA的水平。與TCDD(3 nmol/L)單一暴露相比，Cd2+(0～30 μmol/L)和TCDD(3 nmol/L)聯合暴露顯著抑制了CYP1A1遠端啟動子區域的熒光素酶報告基因和合成的3XRE基因啟動子的活性。表明Cd2+通過轉錄抑制降低了TCDD誘導的CYP1A1水平。蛋白質組學分析結果顯示，TCDD單一暴露導致一些與糖酵解有關的蛋白表達下調，而與Cd2+聯合暴露則表達上調，表明Cd2+和TCDD可以通過影響糖酵解通路相關基因來干擾能量代謝。蛋白酶體是在細胞暴露于Cd2+和TCDD后表達改變的另一組重要蛋白質。4種亞型的蛋白酶體(PMSA1、PMSA2、PMSA4和PMSA7)在TCDD暴露后表達下調，但與Cd2+聯合暴露后表達上調。蛋白酶體途徑可能通過降解異常蛋白來保護斑馬魚肝細胞免受Cd2+和TCDD的毒性，也可能促進AhR/ARNT2b的降解，從而減少該復合物在細胞核中的積累[85]。

3.3 TCDD與鉛聯合暴露

在人肝癌HepG2細胞中，Pb2+能夠以濃度依賴性的方式降低TCDD介導的CYP1A1基因在mRNA、蛋白和催化活性水平上的表達。HepG2細胞的試驗結果證明，Pb2+可能通過誘導血紅素氧合酶-1 (HO-1)基因表達以及活性氧的產生，從而降低CYP1A1的活性[86]。而在小鼠Hepa 1c1c7細胞中，相同濃度的Pb2+顯著增強TCDD對CYP1A1 mRNA的誘導[78]。Pb2+對CYP1A1基因調控的物種特異性作用可以歸因于核易位、通過染色質重塑活化轉錄以及AhR的蛋白酶體降解的差異[87]。

3.4 TCDD與砷聯合暴露

Chen等[88]在斑馬魚肝細胞系中，通過蛋白質組學方法研究了TCDD和As3+單一及聯合暴露導致的相關胞質蛋白表達差異，鑒定了42種蛋白質，主要涉及新陳代謝、應激反應和氧化等相關蛋白。TCDD通過改變相關酶的活性來破壞糖酵解和糖異生[89]。與糖酵解有關的蛋白中，二磷酸醛縮酶A/C-B(ALDO)、烯醇化酶1/3(ENO)和乳酸脫氫酶(LDH)經TCDD暴露后表達均下調，而與As3+聯合暴露則表達上調。糖酵解途徑是許多細胞的主要能量來源，因此TCDD和As3+對這些蛋白的影響表明TCDD可能破壞糖酵解過程，降低能量生產，而這種抑制可以被As3+逆轉。此外，參與糖異生的線粒體酶蘋果酸脫氫酶(MDH)在TCDD暴露后表達上調，但與As3+共同暴露后表達下調，證明TCDD也可能促進糖異生，而As3+可能逆轉TCDD引起的能量代謝失衡。受TCDD和As3+影響的另一個重要途徑是對化學脅迫的應激反應。在蛋白質組學研究中，鑒定了5種熱休克蛋白(HSPs)和1種應激誘導的磷蛋白(STIP)，這些蛋白在TCDD單一暴露后表達均顯著下調，而與As3+聯合暴露后表達上調。金屬誘導熱休克蛋白被認為是對金屬暴露的一種防御機制[90-91]。HSP90在AhR復合體中的主要作用是保持AhR的適當折疊和穩定性，蛋白豐度的降低表明AhR復合物水平降低，而AhR/ARNT2b異源二聚體增加。與As3+聯合暴露后這些蛋白表達上調表明可能需要更多的熱休克蛋白來形成AhR復合物并將其保存在細胞質中，抑制AhR的核轉位與ARNT結合。TCDD通過誘導CYP1A1基因表達，增加電子向分子氧的轉移，導致活性氧的形成和脂質過氧化，產生毒性[92]。包括As3+在內的微量金屬可通過氧化狀態循環或與抗氧化劑相互作用而增加炎癥，從而導致細胞內自由基的積累，誘導氧化應激。谷胱甘肽還原酶(GTR)可以催化谷胱甘肽二硫化物還原成巰基狀谷胱甘肽(GSH)，是抵抗氧化應激和維持細胞還原環境的關鍵分子[93]。TCDD暴露導致GTR表達上調，可能是機體對氧化應激誘導的一種保護性反應，而與As3+聯合暴露時其表達下調，表明As3+可能抑制了這一防御系統。TCDD與汞、鎘、鉛、砷聯合暴露毒性效應與機理見表2。

表2 TCDD與汞、鎘、鉛、砷聯合暴露毒性效應與機理

4 小結

(1)TCDD與汞、鎘、鉛、砷聯合暴露的生態效應和健康風險，與每種化合物的毒性機制所預期的效應相比有顯著差異。聯合暴露導致一些生物效應與基因的表達呈現協同、加性或拮抗效應，還會誘導一些不同于單一暴露導致的疾病和基因表達。

(2)單一污染物不可見效應濃度組成的混合物長期暴露，仍然導致生態效應和健康損害。

(3)TCDD和汞、鎘、鉛、砷在環境中聯合暴露時，重金屬可以通過改變CYP1A1基因的表達來增強或降低TCDD的致癌性。不同重金屬與TCDD聯合暴露的生物反應與基因表達有顯著差異。

5 展望

建立有效的有機化學物質和重金屬混合物毒性效應評價方法是一個急需解決的問題。盡管面臨著全面搞清環境中存在的有害、有毒化學污染物種類，揭示化學污染物聯合毒性效應機理，建立化學物質混合物毒性效應評價方法的挑戰，但是隨著遺傳學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學、暴露組學、高通量化學物質毒性效應評價技術和生物信息學的快速發展，化學物質AOP打開了從分子層面揭示化學物質毒性效應本質的大門，為建立基于基因表達水平來評價化學物質聯合毒性效應方法提供了基礎。目前，我們仍然面臨著如何將化學物質毒性效應分子機理與毒性效應導致的形態變化聯系起來這個毒理學要解決的核心問題。