微生物菌劑強(qiáng)化A/O脫氮反應(yīng)器運(yùn)行效果及微生物群落變化

金位棟，焦巨龍，李劍屏，楊蘇文*，閆玉紅，張玥

1.湖泊水污染治理與生態(tài)修復(fù)技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院 2.北京市市政工程設(shè)計(jì)研究總院有限公司

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置和方法

試驗(yàn)用反應(yīng)器(圖1)有效容積為100 L，采用不透明有機(jī)玻璃制作，反應(yīng)器含2個(gè)隔室，從左至右依次為缺氧池和好氧池，其單元有效體積比為1∶1。試驗(yàn)過(guò)程中，缺氧池沿用傳統(tǒng)的活性污泥法，采用攪拌裝置攪拌，使溶解氧(DO)濃度保持在0.2 mgL以下；在好氧池底部設(shè)置微氧曝氣頭，并添加固定載體(天然陶瓷經(jīng)高溫?zé)Y(jié)形成的中空柱體)形成生物膜，出水DO濃度保持在2 mgL左右；溫度變化范圍為20～30 ℃，pH變化范圍為6.5～8.5；采用蠕動(dòng)泵控制進(jìn)水和硝化液回流比。

1—pH計(jì)；2—溫度計(jì)；3—DO探頭；4—加熱棒；5—轉(zhuǎn)速控制器；6—攪拌器；7—進(jìn)水箱；8—填料；9—曝氣頭；10—蠕動(dòng)泵。圖1 反應(yīng)器結(jié)構(gòu)Fig.1 Reactor structure

試驗(yàn)過(guò)程分為3個(gè)階段：第1天～第30天為啟動(dòng)階段，第31天～第130天為優(yōu)化運(yùn)行階段，第131天～第200天為投加微生物菌劑階段。各階段進(jìn)水水質(zhì)及運(yùn)行條件見(jiàn)表1。在優(yōu)化運(yùn)行階段依次調(diào)節(jié)HRT(第31天～第60天)、CN(第61天～第90天)和硝化液回流比(第91天～第130天)3個(gè)運(yùn)行參數(shù)，以確定最優(yōu)運(yùn)行條件；在投加微生物菌劑階段，采用優(yōu)化運(yùn)行階段獲得的最佳HRT、CN 和硝化液回流比運(yùn)行，考察投加氨氮去除菌劑(第131天～第170天)、反硝化菌劑(第171天～第200天)條件下反應(yīng)器的運(yùn)行效果。

表1 反應(yīng)器不同階段進(jìn)水水質(zhì)和運(yùn)行條件

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用污泥取自北京市海淀區(qū)永豐再生水廠(chǎng)氧化溝前端的好氧污泥。試驗(yàn)選用的固定載體為市場(chǎng)常見(jiàn)材料，載體表面分布有豐富的孔隙(外徑為30 mm，內(nèi)徑為10 mm，長(zhǎng)度約為25 mm，比表面積為1 000 m2/m3)，利于世代時(shí)間長(zhǎng)的硝化菌的生長(zhǎng)和掛膜，試驗(yàn)過(guò)程中載體表面形成的生物膜厚度隨運(yùn)行時(shí)間增加而增大，老化后自行脫落。

試驗(yàn)用水為模擬生活污水，采用葡萄糖、氯化銨(NH4Cl)和磷酸二氫鉀(KH2PO4)提供相應(yīng)的碳源、氮源和磷源，添加微量元素和礦物質(zhì)元素溶液。主要試劑：NH4Cl；KH2PO4，54 mg/L；FeSO4·7H2O，9 mg/L；EDTA，5 mg/L；礦物質(zhì)元素濃縮液，2 mL/L；微量元素濃縮液，1 mL/L。礦物質(zhì)元素濃縮液組成：CaCl2，0.7 g/L；KCl，0.7 g/L；MgSO4，0.5 g/L；NaCl，0.5 g/L。微量元素濃縮液組成：CoCl2·6H2O，0.24 mg/L；CuSO4·5H2O，0.25 mg/L；H3BO3，0.014 mg/L；MnCl2·4H2O，0.99 mg/L；Na2MoO4·2H2O，0.22 mg/L；NiCl·6H2O，0.19 mg/L；ZnSO4·7H2O，0.43 mg/L[12]。

1.3 監(jiān)測(cè)指標(biāo)及分析方法

1.4 高通量測(cè)序分析

分別取原始污泥樣品和3個(gè)階段(第30天、第130天和第200天)好氧池中7個(gè)泥樣進(jìn)行微生物群落分析，分別為CK(原始污泥樣品)、A1(啟動(dòng)階段缺氧池樣品)、O1(啟動(dòng)階段好氧池樣品)、A2(優(yōu)化運(yùn)行階段缺氧池樣品)、O2(優(yōu)化運(yùn)行階段好氧池樣品)、A3(投加菌劑階段缺氧池樣品)和O3(投加菌劑階段好氧池樣品)。樣品置于50 mL離心管中以15 000 r/min離心10 min，將離心得到的固體樣品轉(zhuǎn)移至送樣管中，置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存。采用環(huán)境樣本DNA提取試劑盒(ZYMO Research公司)進(jìn)行基因組DNA抽提，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取質(zhì)量；采用具有Barcode標(biāo)記的引物515F與806R對(duì)細(xì)菌16S rRNA V3—V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純化效果；用Qubit 2.0對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量，使用試劑盒TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep kit(FC-121-3001/3002，Illumina公司)進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，委托北京源宜基因科技股份有限公司進(jìn)行基因測(cè)序工作。

對(duì)樣品進(jìn)行Alpha多樣性分析，衡量物種多樣性，計(jì)算Chao、Ace、Coverage、香農(nóng)指數(shù)(Shannon)和辛普森指數(shù)(Simpson)5種多樣性指數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)器運(yùn)行效果

2.1.1啟動(dòng)階段

圖2 AO反應(yīng)器不同運(yùn)行階段與濃度變化Fig.2 Variation of concentration at different stages in the A/O reactor

2.1.2優(yōu)化運(yùn)行階段

2.1.2.1HRT對(duì)去除效果的影響

圖3 不同HRT時(shí)COD、TN和的去除效果Fig.3 Removal effects of COD,TN and under different hydraulic residence time

圖4 不同CN時(shí)COD、TN和的去除效果Fig.4 Removal effects of COD,TN and at different C/N ratios

2.1.2.2C/N對(duì)去除效果的影響

2.1.2.3硝化液回流比對(duì)去除效果的影響

圖5 不同硝化液回流比條件下COD、TN和的去除效果Fig.5 Removal effects of COD,TN and under the condition of different nitrification liquid reflux ratio

2.1.3投加微生物菌劑階段

圖6 投加去除菌劑條件下COD、TN和的去除效果Fig.6 Removal effects of COD,TN and by adding ammonia nitrogen removal agent

2.1.3.2反硝化菌劑對(duì)去除效果的影響

表2 反應(yīng)器不同運(yùn)行階段樣品中微生物多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖7 投加反硝化菌劑條件下COD、TN和的去除效果Fig.7 Removal effects of COD,TN and by adding denitrifying agent

2.2 微生物多樣性分析

Chao指數(shù)和Ace指數(shù)可反映群落中物種的數(shù)量，在不考慮豐度時(shí)[21]，Coverage表示測(cè)序深度指數(shù)[22]。Shannon和Simpson指數(shù)都可用來(lái)判斷多樣性，但代表的意義相反。Shannon指數(shù)越大，說(shuō)明樣品中的群落數(shù)越高且復(fù)雜，同時(shí)也可反映菌群的均勻度[23-25]；而Simpson是指從一個(gè)群落中進(jìn)行2次連續(xù)抽樣所得到的物種數(shù)屬于同一物種的概率。反應(yīng)器不同運(yùn)行階段樣品中多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示。由表2可知，樣品的Coverage均在0.990以上，表明樣品中所有的序列均被檢測(cè)了出來(lái)，且數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。除O1樣品的Shannon指數(shù)低于CK外，其他好氧池樣品的Shannon指數(shù)均高于CK，這可能是由于好氧池內(nèi)生物膜形成條件使得原有污泥中多數(shù)異養(yǎng)菌被淘汰。對(duì)比添加菌劑前后缺氧池中微生物多樣性可知，缺氧池的微生物多樣性不斷提高，表明微生物菌劑的投加提高了反應(yīng)器內(nèi)微生物的多樣性，進(jìn)而提高了對(duì)污染物的去除率。好氧池的Shannon指數(shù)在添加菌劑前升高，在添加菌劑后下降，推測(cè)其原因可能是由于菌劑的添加使反應(yīng)器內(nèi)原有部分菌群被淘汰。Simpson指數(shù)結(jié)果與Shannon指數(shù)結(jié)果相符。

群落結(jié)構(gòu)圖組成反映不同分類(lèi)水平下不同樣品中微生物種類(lèi)的相對(duì)豐度，可表示微生物群落的結(jié)構(gòu)變化[26]。7個(gè)樣品中菌群門(mén)水平相對(duì)豐度如圖8所示。由圖8可知，原始污泥樣品中主要的細(xì)菌門(mén)有變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bateroidetes)、芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)、Candidate_division_TM7菌門(mén)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、綠菌門(mén)(Chlorobi)、硬壁菌門(mén)(Firmicutes)、硝化螺旋菌門(mén)(Nitrospirae)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)和疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)等，相對(duì)豐度分別為63.6%、14.2%、7.7%、3.3%、2.1%、0.4%、0.1%、0.2%、0.3%、0.7%和1.8%。

Proteobacteria中通常含有脫氮菌，如亞硝酸鹽氧化菌[27]，其是水處理工藝中最常見(jiàn)的細(xì)菌門(mén)[28]；此外，Proteobacteria中的個(gè)別屬可以在低DO濃度條件下進(jìn)行脫氮，是重要的脫氮者[29]；Proteobacteria中的變形桿菌具有多種代謝方式，對(duì)碳、氮、硫循環(huán)具有重要意義[30]。Bateroidetes是異養(yǎng)細(xì)菌，通過(guò)消耗碳水化合物和復(fù)雜的有機(jī)物來(lái)完成自身代謝[31]，通常對(duì)有機(jī)碳源具有很強(qiáng)的耐受性。Chloroflexi和活性污泥絲狀膨脹有密切關(guān)系，其豐度占比大小直接影響到污泥系統(tǒng)的運(yùn)行[31-33]。此外，Chloroflexi常與Candidate_division_TM7和Bateroidetes共同存在，三者可黏附蛋白質(zhì)、淀粉等物質(zhì)，使污泥沉降性能變差，造成污泥膨脹。Chloroflexi通常是以反應(yīng)器中的生物殘?bào)w為食，是典型的異養(yǎng)菌，且與Chlorobi均屬于光合細(xì)菌的一部分[34]。Candidate_division_TM7可以促進(jìn)污泥膨脹，強(qiáng)化對(duì)碳素的吸附、貯存作用[35]。Acidobacteria是嗜酸菌，現(xiàn)有研究較少，但在生態(tài)系統(tǒng)中具有重要作用。Firmicutes與Bateroidetes類(lèi)似，均為異養(yǎng)菌[33,36]。Nitrospirae會(huì)使系統(tǒng)內(nèi)有更多的硝化細(xì)菌，與亞硝化反應(yīng)的進(jìn)行有重要聯(lián)系[37]。

圖8 7個(gè)樣品中菌群門(mén)水平相對(duì)豐度Fig.8 Horizontal relative abundance of phyla in 7 samples

反應(yīng)器啟動(dòng)階段，缺氧池和好氧池內(nèi)細(xì)菌的相對(duì)豐度變化較大。缺氧池中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)為Proteobacteria、Bacteroidetes、Gemmatimonadetes、Acidobacteria、Firmicutes、Chloroflexi和Actinobacteria，其相對(duì)豐度之和超過(guò)75%，該結(jié)果與已有研究結(jié)果[20,37]相似。相較原始污泥中各細(xì)菌門(mén)的相對(duì)豐度，該階段缺氧池中Proteobacteria、Bacteroidetes的相對(duì)豐度迅速降低，分別從63.6%、14.2%降至21.6%、2.7%；而Actinobacteria和Chloroflexi的相對(duì)豐度則大幅提高，分別從原始污泥中的0.7%、0.3%升至21.1%、5.6%，表明在人工配水條件下，缺氧池中馴化的是異養(yǎng)菌，對(duì)有機(jī)物有良好的去除效果。好氧池中，Proteobacteria相對(duì)豐度變化可能與好氧池進(jìn)水的有機(jī)物濃度有關(guān)，導(dǎo)致自養(yǎng)菌相對(duì)豐度降至16.1%；而Acidobacteria屬于嗜酸菌，可能是由于硝化過(guò)程中pH變化，導(dǎo)致其相對(duì)豐度從原始污泥階段的2.1%顯著上升至35.7%。

投加微生物菌劑階段，系統(tǒng)中微生物群落發(fā)生了變化。缺氧池中占據(jù)主導(dǎo)地位的細(xì)菌門(mén)變?yōu)镻roteobacteria、Bateroidetes、Chlorobi和Firmicutes，4種細(xì)菌門(mén)的相對(duì)豐度之和達(dá)75.4%。與優(yōu)化運(yùn)行階段相比，Chlorobi相對(duì)豐度顯著增加，從0.2%升至3.0%，增強(qiáng)了系統(tǒng)對(duì)有機(jī)物的去除效果；Candidate_division_TM7的相對(duì)豐度降至0.3%，表明缺氧池中不會(huì)出現(xiàn)污泥膨脹等問(wèn)題。好氧池添加氨氮去除菌劑后，占據(jù)主導(dǎo)地位的Proteobacteria和Bateroidetes相對(duì)豐度之和提高至92.3%，Proteobacteria相對(duì)豐度的增加使反應(yīng)器中硝化反應(yīng)良好，脫氮效果提高。Bateroidetes相對(duì)豐度較優(yōu)化運(yùn)行階段降低10.0%，可能是由于缺氧池對(duì)有機(jī)物去除能力增加使進(jìn)入好氧池的有機(jī)物濃度降低，從而使異養(yǎng)菌數(shù)量減少造成的。

3 結(jié)論

(4)原始污泥中細(xì)菌以Proteobacteria和Bateroidetes為主，二者相對(duì)豐度之和達(dá)77.8%；反應(yīng)器啟動(dòng)階段，細(xì)菌種類(lèi)大幅增多，缺氧池內(nèi)Proteobacteria相對(duì)豐度下降了約42個(gè)百分點(diǎn)，Actinobacteria上升了約20個(gè)百分點(diǎn)，好氧池內(nèi)Acidobacteria上升了約34個(gè)百分點(diǎn)；系統(tǒng)優(yōu)化運(yùn)行后，細(xì)菌種類(lèi)數(shù)略有下降但多樣性指數(shù)顯著提升，Proteobacteria和Bateroidetes相對(duì)豐度逐步回升；投加微生物菌劑后，缺氧池內(nèi)Proteobacteria和Bateroidetes相對(duì)豐度下降，細(xì)菌種類(lèi)數(shù)和多樣性增加，而好氧池內(nèi)Proteobacteria和Bateroidetes相對(duì)豐度之和增至90.0%以上，細(xì)菌種類(lèi)數(shù)及多樣性下降。